Micromanipulación y microinyección de vesículas unilamelares gigantes.

ANGELETTI S.C., CLOP P.D., GARCÍA D.A. Y PERILLO M.A..

Bs As

Congreso; XL Reunión Anual de la Sociedad Argentina de Biofísica.; 2011

Sociedad Argentina de Biofísica.

Con el objetivo de incorporar a los sistemas experimentales características que se aproximen a los sistemas naturales y donde las condiciones variables de la organización del medio pudieran ser sometidas al control experimental, nos propusimos implementar en nuestro laboratorio el modelo de vesículas unilamelares gigantes (GUVs). Las GUVs,   constituidas por una única  bicapa lipídica y con un diámetro en el orden de los micrómetros,  simulan una membrana celular estructuralmente simple y pueden ser utilizadas como un microreactor mediante la aplicación de técnicas de microinyección (1). Si bien los primeros reportes de su preparación datan desde 1986 (1) y en los últimos años vienen siendo utilizadas con una frecuencia creciente (2), la metodología inherente a su preparación y especialmente a su microinyección presenta dificultades experimentales. Por tal motivo, en el presente trabajo realizamos un estudio sistemático de estos procesos. Se aplicaron diversos protocolos para la preparación de GUVs. El método de electroformación, a partir de la hidratación de una película de lípidos (POPC), previamente depositada tanto en un alambre de platino como en electrodos ITO, en presencia de un campo eléctrico, permitió obtener poblaciones de vesículas con un tamaño homogéneo y un alto porcentaje de unilamelaridad. Seleccionamos para la microinyección el sistema de electrodo de platino donde los GUVs permanecen levemente adheridos facilitando su manipulación. Sin embargo, los GUVs no fueron fácilmente penetrables, por lo que se ensayaron diferentes estrategias de microinyección variando las dimensiones y la química superficial de la pipeta,  la composición del vehículo de inyección y el potencial eléctrico aplicado a la pipeta, hasta lograr introducir una sonda fluorescente soluble. Nuestros resultados indican que la principal barrera para la microinyección son las repulsiones electrostáticas entre la pipeta y la membrana. Referencias: (1) Luisi P. and Walde M. (2000) Giant Vesicules. Editorial Borrad vol. 6. (2)  Ambroggio E., Separovic F., Bowie J., Fidelio G. And Bagatolli L. (2005) Direct Visualization of Membrane Leakage Induced by the Antibiotic Peptides: Maculatin, Citropin, and Aurein. Byophysical Journal 89:1874-1881.