FABRICACIÓN DE UNA COLUMNA DE FASE ESTACIONARIA MONOLÍTICA PARA CROMATOGRAFÍA DE PROTEÍNAS.

ELIZABETH PÉREZ; MIRNA LORENA SANCHEZ; JOSÉ G. GONZÁLEZ-VALDEZ; MARCO A. MATA-GÓMEZ

Congreso; Congreso Nacional de Biotecnologia y Bioingeniería; 2021

Introducción. La cromatografía adsortiva es un proceso muy utilizado en la industria biotecnológica para recuperación de proteínas. La fase estacionaria juega un papel indispensable en este tipo de técnicas, debido a esto, es necesario el desarrollo de nuevos materiales con el objetivo de mejorar la eficiencia de la purificación de las proteínas. Los monolitos, materiales poliméricos porosos, han adquirido gran interés en el desarrollo de fases estacionarias para cromatografía de proteínas debido a su estabilidad mecánica y química, así como la característica de poseer una mayor tasa de transferencia de masa comparada a resinas de cromatografía tradicionales (1). La modificación química de monolitos con ligandos novedosos es un área que sigue creciendo para generar soportes cromatográficos con un mejor desempeño. En ese sentido, se propone la fabricación de un monolito a base de metacrilatos dentro de una columna de polipropileno impresa en 3D y su posterior modificación con ácido ᵧ-guanidino butírico (Gnd) para generar un adsorbente cromatográfico de intercambio aniónico. Este ligando tiene una estructura resonante de grupos amino cuyo pKa de 12.07 permite que esta molécula se mantenga cargada positivamente en un amplio rango de pH (2). Por lo tanto, esta estrategia permite generar un adsorbente de intercambio aniónico funcional en un amplio rango de pH.Metodología. La columna cromatográfica (5 mm d.i. x 20 mm altura) se diseñó en AutodeskAutoCAD 2021. La impresión del diseño se llevó a una impresora Ultimaker S5 usando filamento de polipropileno reforzado con 30% fibra de vidrio (BASF Black Ultrafuse, PPGF 30). Los monolitos fueron fabricados dentro de la columna usando glicidil dimetacrilato co-polimerizado con dimetacrilato de etilenglicol (GMA-co-EDMA). La pared de la columna de PPGF 30 fue silanizada y después modificada con 3-(trimetoxisilil) propil metacrilato (ᵧ-MAPS) (3). Posteriormente, el ᵧ-MAPS de la pared de la columna se coopolimerizo con GMA y EDMA (GMA-co-EDMA) (4). Para la incorporación del ligando Gnd, primero se hizo recircular una solución de etilendiamina (EDA, 50% v/v) a 60 °C por 12 h a través de la columna usando microbombas de jeringa (20uL/min), seguido de la recirculación de una solución de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC) 0.1M conteniendo Gnd (10mg/mL) a temperatura ambiente. Se evaluó el desempeño del monolito modificado con guanidino (M-Gnd) para adsorber proteína. Para esto, se hizo pasar una solución de BSA (2.5 mg/mL) a través de la columna monolítica modificada con GnD y la no modificada (GMA-co-EDMA), previamente equilibradas con buffer Tris pH 8.5, 10 mM, a un flujo de 250 uL/min. La desorción se realizó con NaCl 1M y se determinó el porcentaje de retención de proteína.Resultados. Fig. 1. (A) Modelo CAD de la columna (5 mm ID x 20 mm largo). (B) Columna impresa en polipropileno reforzado con fibra de vidrio (PPGF 30). (C) Vista transversal de la columna impresa en PPGF 30, fecha roja señala monolito polimerizado en el canal.Tabla 1. Porcentaje de retención de BSA en el monolito modificado (M-Gnd) y no modificado (GMA-co-EDMA).Fase estacionariaProteína adsorbidaPorcentaje de retenciónGMA-co-EDMA0.37 mg7.4%M-Gnd1.57 mg34%Conclusiones. Se logró sintetizar y modificar un monolito funcional de GMA-co-EDMA con el ligando ácido 4-guanidino butírico en columnas de polipropileno impresas en 3D (Fig. 1) con el objetivo de obtener una fase estacionaria de intercambio aniónico para la separación de proteínas. El monolito fabricado M-Gnd mostró una capacidad de adsorción de proteína BSA de 34%, mientras que el monolito no modificado retuvo poca cantidad de proteína, 7%, Tabla 1. Por lo tanto, la adsorción se debe a la presencia del ligando GnD. La columnas será caracterizada químicamente y se evaluará su desempeño cromatográfico a detalle.Agradecimiento. Los autores agradecen al Tecnológico de Monterrey por el apoyo a través del Grupo de Investigación del Grupo de Bioprocesos. MLS es un miembro del CONICET. Elizabeth Pérez agradece al CONACyT por la beca No. 1048547. Bibliografía.1.Lynch, K. B., Ren, J., Beckner, M. A., He, C., & Liu, S.(2018). Anal. Chim. Acta. 1046: 48-68 2.David, C. (2019). Chemical synthesis of an anion exchange adsorbent using γ-guanidinobutyric acid as a ligand for the separation of proteins. Tesis de maestría en Ciencias en Biotecnología. Tecnológico de Monterrey, Monterrey.3.Abdulhussain, N., nawada, S., Currivan, S., Passamonti, M., & Schoenmakers, P. (2020). J. Chromatogr A, 1623 (461159)4.Lin, L., Chen, H., Wei, H., Wang, F., & Lin, J.-M. (2011). Analyst. 136(20): 4260-4267