La matriz del biofilm de S. xylosus como posible antígeno vacunal para mastitis bovina.

CONESA A; RAMPONE A; SODERO S; ISAAC P; BOHL LP; BRESER ML; RASPANTI CG; PORPORATTO C

La Plata

Encuentro; Reunión 2019 RELIM; 2019

Red Latinoamericana de Investigación en Mastitis

Introducción.Staphylococcus no-aureus (NAS), son reconocidos en todo el mundo como agentes etiológicos de las infecciones intramamarias en el ganado bovino [Condas., 2017]. La patogenicidad de las especies de NAS está asociada con la presencia de distintos factores de virulencia, entre ellos, la formación de biofilm que aumenta la capacidad de permanencia y determina la cronicidad de las infecciones [Darwish., 2013]. Las rutinas de desinfección pre y post-ordeñe y la terapia con antibióticos al secado como métodos de control, a menudo resultan ineficientes para prevenir o eliminar las infecciones crónicas producidas por grupos bacterianos con capacidad para formar biofilm [Melchior., 2017]. La ineficacia de estos procedimientos prioriza la investigación hacia la búsqueda de métodos de control alternativos, como vacunas, o sustancias naturales, como un enfoque preventivo a infecciones. El objetivo de este trabajo fue evaluar como inmunógeno a componentes de la matriz del biofilm de una cepa Staphylococcus coagulasa negativo aislada de mastitis bovina, asociado a quitosano o a hidróxido de aluminio como adyuvantes. Para ello, el grupo de trabajo se propuso profundizar el estudio de cepas de este género bacteriano aisladas de muestras de leche de mastitis bovinas previamente aisladas en la zona, identificarlas por diferentes métodos bioquímicos y moleculares, evaluar su capacidad de formación de biofilm, la interacción con las células epiteliales MAC-T y la respuesta inmune inducida. Se evaluó la capacidad de adherencia, internalización y sobrevida de 3 especies de SCN más prevalentes aisladas en la cuenca lechera de Villa María y se investigó la posible asociación con la capacidad para formación de biofilm. Para caracterizar las respuestas inmunes innatas se midió la concentración de citoquinas pro-inflamatorias IL-6 e IL-1β inducidas por la estimulación in vitro de la línea celular empleando la técnica de ELISA. Luego de un minucioso proceso de selección, se eligió la cepa S.xylosus 222 como candidata de interés para obtener el inmunógeno deseado.Materiales y Métodos. Se seleccionó la cepa S. xylosus 222 aislado de muestras de leche de vacas pertenecientes a tambos de la región sur-este de la provincia de Córdoba [Dieser., 2014] e identificadas a nivel de especie por PCR-RFLP del gen gap y MALDI-TOF MS [Conesa., 2017]. Se utilizó como inmunógeno una suspensión de la matriz del biofilm de la cepa seleccionada. Para ello, la matriz del biofilm fue obtenida a partir de un cultivo estático en placa de Petri, concentrada por centrifugación, inactivada por calor y liofilizada. Para la inmununización se utilizaron 40 vaquillonas Holstein preñadas en el último trimestre de gestación, y se las dividió en 4 grupos (n=10). Cada uno de ellos recibió las siguientes formulaciones: grupo no inmunizado (NI): 2 ml de solución fisiológica estéril (SF); grupo inmunizado control (Al): 2 ml del inmunógeno con hidróxido de aluminio como adyuvante (Ad); grupo inmunizado (QI): 2 ml del inmunógeno con quitosano como Ad; y grupo control de Ad (C): SF + Q. Se aplicaron tres inyecciones subcutáneas en la tabla del cuello, a los 60 y 30 días previos a la fecha de parto. Se recolectaron 10 ml de sangre de la vena coccígea de vaquillonas a los días 0, 14, 21, 28, 35, 42 y 49 post-inoculación, se obtuvo suero el que fue almacenados a -20 ° C hasta su análisis. Se determinaron los niveles de anticuerpos específicos IgG anti-biofilm en sangre por ELISA. Para ello, placas de 96 pocillos (Nunc-ImmunoPlaca Maxi SorbTM) fueron sensibilizadas con la matriz de biofilm a una concentración de 1x109 UFC/mL según protocolos descriptos previamente [Camussone., 2013]. Se incubaron los sueros diluidos, se usó un anticuerpo secundario anti-IgG bovina conjugado a peroxidasa (Sigma) y se reveló con una solución de sustrato/cromógeno TMB (Pierce).Resultados y Discusión.Sobre los parámetros de caracterización, no hubo diferencias significativas atribuibles a la especie para los parámetros adherencia e internalización, sin embargo la sobrevida fue significativamente superior para S. xylosus. En cuanto a la capacidad de formación de biofilm, aquellas bacterias que presentan una menor capacidad de formación de biofilm mostraron una capacidad de internalizar significativamente mayor. El ensayo de interacción con MAC-T, mostró que sólo una cepa de S. xylosus desencadenó un incremento en la producción de ambas citoquinas (ELISA). La respuesta inflamatoria inducida por esta cepa de S. xylosus resultó de interés dado que esa es una de las especies de SCN más prevalente y que presenta una fuerte capacidad para formar biofilm, resultando una candidata para obtener posibles antígenos vacunales. En el ensayo de inmunización in vivo, no se observaron reacciones adversas a la inoculación en ninguno de los animales incluidos en este estudio. Los resultados obtenidos hasta el momento muestran en ambos grupos vacunados (QI y AL) un incremento en el nivel de IgG séricas especificas anti-matriz del biofilm, que en sus puntos máximos (alcanzados 14 días luego de la primera inoculación y 7 días de la segunda) llego a ser 50% superior respecto a los controles. Si bien los niveles de anticuerpos comenzaron a decaer a los 7 días de alcanzar el pico, se observó un nivel más sostenido luego de la segunda dosis en los grupos inmunizados QI y AL.Conclusiones.Se obtuvo un inmunógeno con una probada actividad in vitro para generar respuesta contra estructuras y componentes bacterianos que cumplen un rol determinante, tanto en las primeras etapas de la interacción huésped-patógeno como en la permanencia y en la evasión del sistema inmune, y en etapas más avanzadas de la infección. Esto permite proponerlo como un candidato interesante para futuras formulaciones de vacunas contra mastitis estafilocócicas.Referencias.1.Boerhout, et al. 2018. Vet Res. 49(1): 25.2.Camussone and Calvinho. 2013. Rev Argent Microbiol. 45(2): 119-1303.Condas et al. 2017. J Dairy Sci. 100(7): 5592-5612.4.Darwish, et al. 2013. Sci. World J., 5.Dieser, S., et al. 2014. Pak Vet J. 34(1): 124-126. 6.Conesa, A., et al. 2017. Reunión Conjunta de Soc. de Biociencias XIX. 7. Melchior et al. 2006. Vet J. 171(3): 398-407.8.Prenafeta, et al. 2010. Vet Immuno Immunop. 134(3-4): 208-217