Detección y tipificación de Pseudumonas aeruginosa mediante un ensayo de PCR-RFLP a partir de muestras clínicas recuperadas de pacientes pediátricos

LAGARES, ANTONIO; AGARAS, BETINA; BETTIOL, MARISA; GATTI, BLANCA; VALVERDE, CLAUDIO

Ciudad autónoma de Buenos Aires

Congreso; XII Congreso Argentino de Microbiología; 2010

Asociación Argentina de Microbiología (AAM)

Introducción: Para contar con métodos rápidos de tipificación de P. aeruginosa (P.a.) que no requieran una etapa de cultivo, es necesario identificar regiones génicas que sean marcadores específicos de especie. En nuestro laboratorio se evaluó previamente a través del diseño de un ensayo de PCR-RFLP (Polymerase chain reaction ? Restriction Fragment Length Polimorfism), la potencialidad del gen oprF, altamente conservado en Pseudomonas y con una marcada diversidad de secuencia, para ser utilizado como marcador de especie en aislamientos recuperados de muestras ambientales, obteniéndose resultados favorables. Objetivo: Evaluar la capacidad de un protocolo de PCR-RFLP para genotipificar aislamientos recuperados de muestras clínicas identificados como P. aeruginosa por métodos microbiológicos convencionales. Material y Métodos: Cultivos en medio selectivo para Pseudomonas spp. Extracción de ADN. Reacción de PCR dirigida a un fragmento interno del gen oprF utilizando cebadores complementarios a secuencias conservadas en Pseudomonas. Análisis RFLP generados con endonucleasas TaqI y HaeIII. Resolución por electroforesis en gel de agarosa, tinción con bromuro de etidio y visualización al transiluminador UV. Resultados: Se construyó una colección de 62 aislamientos de P.a. obtenidos a partir de diferentes tipos de muestras clínicas y diferentes secciones del Hospital de Niños de La Plata. El tamaño del 98% de los amplicones oprF fue indistinguible del de cepas de referencia. Sólo un aislamiento generó un producto con tamaño menor, y se verificó luego por secuenciación que se trataba de una cepa de P. mendocina. Se analizaron los RFLP obtenidos mediante el uso de las endonucleasas TaqI y HaeIII sobre los productos de PCR, para conocer el grado de diversidad en las secuencias de los amplicones oprF, y evaluar la posibilidad de utilizar los mismos como herramienta de genotipificación a nivel de especie. El 96% de los aislamientos de P.a. presentaron patrones de digestión con TaqI y HaeIII coincidentes con los de las cepas de referencia. El restante 4%, si bien presentaba productos de amplificación por PCR con tamaño indistinguible a los del resto, mostró un segundo tipo de patrón de RFLP con la enzima HaeIII. Estos últimos aislamientos fueron posteriormente reconfirmados como P.a. mediante secuenciación. Estas observaciones sugirieron que dentro del grupo de P.a. existen al menos 2 posibles patrones de RFLP diferentes. Conclusiones: Se logró amplificar el producto de PCR esperado en la totalidad de los aislamientos de P.a.. El uso de las enzimas TaqI y HaeIII permitió reconocer dos patrones de RFLP, ninguno coincidente con los registrados previamente en nuestro laboratorio para otras especies de Pseudomonas. Esto sienta las bases para el uso del ensayo de PCR-RFLP para la detección y tipificación rápida de P.a.. En una etapa subsiguiente, deberá explorarse de modo sistemático la sensibilidad y especificidad del método utilizando para la PCR ADN extraído directamente de fluidos biológicos colectados de pacientes infectados con P.a..