Amplificación, clonado y secuenciación de genes vip3A de Bacillus thuringiensis

RODRIGUEZ SE, BENINTENDE GB, SAUKA DH

Buenos Aires

Congreso; XII Congreso Argentino de Microbiología. VI Congreso de la Sociedad Argentina de Bacteriología, Micología y Parasitología Clínica (SADEBAC). I Congreso de Microbiología Agrícola y Ambiental (DiMAyA); 2010

Asociación Argentina de Microbiología

Diversos factores de virulencia presentes en Bacillus thuringiensis, le permiten a esta bacteria ser una herramienta fundamental en el control microbiano de plagas. Entre estos factores se encuentra un grupo de proteínas llamadas Vegetative Insecticidal Protein (Vip), que poseen la característica de ser secretadas en fase vegetativa del crecimiento bacteriano. Particularmente, la clase Vip3A esta formada por proteínas de 88 kDa, toxicas frente a larvas de insectos lepidópteros. El estudio de los genes codificantes, podría conducir al hallazgo de variantes nuevas o combinaciones proteicas más eficientes que las conocidas para el control de plagas agrícolas, de gran impacto económico. El objetivo de este estudio, fue plantear una estrategia para la amplificación, clonado y secuenciación de genes vip3A en B. thuringiensis. Para tal fin, se diseñaron 4 pares de cebadores específicos en base al análisis de regiones conservadas, por alineamientos múltiples de sus secuencias de DNA, disponibles a través del sitio “Bacillus thuringiensis toxin nomenclature”(http://www.lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/), empleando ClustalW(http://www.ebi.ac.uk/clustalw/) y Oligoanalyzer 3.0 (http://scitools.idtdna.com/scitools/Applications/OligoAnalyzer/). Estos se utilizaron para amplificación del marco de lectura completo de genes vip3A (2370 pb), mediante PCR hot start manual. La cepa nativa de B. thuringiensis INTA TA24-6 y las exóticas pertenecientes a los serovares kurstaki HD-1 y entomocidus HD-110 se emplearon como controles positivos, mientras que la cepaperteneciente al serovar israelensis HD-567, fue empleado como control negativo. A posteriori, los productos de amplificación fueron extraidos de la matriz del gel y purificados mediante kit WizardSV Gel y PCR Clean-Up System (Promega), clonados en vector pGem-T Easy (Promega) y transformados en células de Escherichia coli JM109. Se seleccionaron al menos 10 colonias blancaspara cada caso, a partir de cultivos en Agar LB conteniendo IPTG y X-gal. Se verifico presencia por PCR del plásmido transformado, utilizando los cebadores del vector SP6 y T7.Tres clones de cada cepa fueron secuenciados en la Unidad de Genómica (Instituto de Biotecnología, INTA.), mediante el uso de los mencionados cebadores del vector y otros 16 cebadores internos específicamente diseñados para tal fin, empleando las herramientas bioinformáticas descriptas anteriormente. Las secuencias de nucleótidos de vip3A de las cepas HD-1, TA24-6 y HD-110 fueron depositadas en la base de datos de GenBank (http://www.ncbi.nnm.nih.gov/) con los numeros de acceso GUO73128 , GUO73129 y HM132031 respectivamente, y denominadas por el Comité de nomenclatura de toxinas de B. thuringiensis como vip3Aa33, vip3Aa34 y vip3Aa37, correspondientemente. Se estableció unaestrategia con una lista detallada de cebadores, que resulto factible para la amplificación, clonado y secuenciación de genes vip3A en B. thuringiensis. Siguiendo esta estrategia se identificaron tres variantes nuevas de estos genes.Bacillus thuringiensis, le permiten a esta bacteria ser una herramienta fundamental en el control microbiano de plagas. Entre estos factores se encuentra un grupo de proteínas llamadas Vegetative Insecticidal Protein (Vip), que poseen la característica de ser secretadas en fase vegetativa del crecimiento bacteriano. Particularmente, la clase Vip3A esta formada por proteínas de 88 kDa, toxicas frente a larvas de insectos lepidópteros. El estudio de los genes codificantes, podría conducir al hallazgo de variantes nuevas o combinaciones proteicas más eficientes que las conocidas para el control de plagas agrícolas, de gran impacto económico. El objetivo de este estudio, fue plantear una estrategia para la amplificación, clonado y secuenciación de genes vip3A en B. thuringiensis. Para tal fin, se diseñaron 4 pares de cebadores específicos en base al análisis de regiones conservadas, por alineamientos múltiples de sus secuencias de DNA, disponibles a través del sitio “Bacillus thuringiensis toxin nomenclature”(http://www.lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/), empleando ClustalW(http://www.ebi.ac.uk/clustalw/) y Oligoanalyzer 3.0 (http://scitools.idtdna.com/scitools/Applications/OligoAnalyzer/). Estos se utilizaron para amplificación del marco de lectura completo de genes vip3A (2370 pb), mediante PCR hot start manual. La cepa nativa de B. thuringiensis INTA TA24-6 y las exóticas pertenecientes a los serovares kurstaki HD-1 y entomocidus HD-110 se emplearon como controles positivos, mientras que la cepaperteneciente al serovar israelensis HD-567, fue empleado como control negativo. A posteriori, los productos de amplificación fueron extraidos de la matriz del gel y purificados mediante kit WizardSV Gel y PCR Clean-Up System (Promega), clonados en vector pGem-T Easy (Promega) y transformados en células de Escherichia coli JM109. Se seleccionaron al menos 10 colonias blancaspara cada caso, a partir de cultivos en Agar LB conteniendo IPTG y X-gal. Se verifico presencia por PCR del plásmido transformado, utilizando los cebadores del vector SP6 y T7.Tres clones de cada cepa fueron secuenciados en la Unidad de Genómica (Instituto de Biotecnología, INTA.), mediante el uso de los mencionados cebadores del vector y otros 16 cebadores internos específicamente diseñados para tal fin, empleando las herramientas bioinformáticas descriptas anteriormente. Las secuencias de nucleótidos de vip3A de las cepas HD-1, TA24-6 y HD-110 fueron depositadas en la base de datos de GenBank (http://www.ncbi.nnm.nih.gov/) con los numeros de acceso GUO73128 , GUO73129 y HM132031 respectivamente, y denominadas por el Comité de nomenclatura de toxinas de B. thuringiensis como vip3Aa33, vip3Aa34 y vip3Aa37, correspondientemente. Se estableció unaestrategia con una lista detallada de cebadores, que resulto factible para la amplificación, clonado y secuenciación de genes vip3A en B. thuringiensis. Siguiendo esta estrategia se identificaron tres variantes nuevas de estos genes.