Diseño in silico de estrategias para la identificación de genes de Bacillus thuringiensis codificantes de proteínas tóxicas para coleópteros

D. H. SAUKA, R. H. MONELLA, G. B. BENINTENDE

Buenos Aires

Congreso; XII Congreso Argentino de Microbiología. VI Congreso de la Sociedad Argentina de Bacteriología, Micología y Parasitología Clínica (SADEBAC). I Congreso de Microbiología Agrícola y Ambiental (DiMAyA); 2010

Las toxinas de Bacillus thuringiensis con toxicidad para insectos coleópteros pertenecen a tres familias que son estructuralmente diferentes: las proteínas Cry, las Vip y las Sip. La importancia de su estudio se basa en que podrían ser empleadas como herramientas para incrementar la actividad tóxica de algunos insecticidas microbianos y combatir la resistencia. Teniendo en cuenta este planteo, emerge la necesidad de disponer de estrategias para identificar sus genes codificantes en B. thuringiensis, que posteriormente permitan el descubrimiento de variantes novedosas. Se diseñaron diversas estrategias basadas en amplificación génica (PCR) para detectar e identificar genes cry14, cry23, cry37 y sip1, PCR multiplex para cry34, y otras seguidas de un análisis de restricción (RFLP) para cry3, cry7, cry8, cry35, vip1 y vip2. Se diseñaron 23 cebadores específicos en base al análisis de regiones conservadas por alineamientos múltiples de sus secuencias de DNA disponibles a través del sitio “Bacillus thuringiensis toxin nomenclature” (http://www.lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/), empleando ClustalW (http://www.ebi.ac.uk/clustalw/) y Oligoanalyzer 3.0 (http://scitools.idtdna.com/scitools/Applications/OligoAnalyzer/). Los fragmentos de DNAesperados son de alrededor de 820 pb para cry3, 434 pb para cry7, 930 pb para cry8, 394 pb para cry14, 702 pb para cry23, 156 pb para cry34A, 274 pb para cry34B, 290 pb para cry35, 330 pb para cry37, 530 pb para vip1, 826 pb para vip2 y 1103 pb para sip1. Los fragmentos de aquellos genes por los que se optó por posterior RFLP fueron digeridos in silico empleando el software Restriction Mapper (http://www.restrictionmapper.org/ ). Mediante el uso de la enzima HinfI se podrían distinguir 4 subclases de genes cry3 y 11 de cry8, con TaqI+RsaI 4 de cry7, y con RsaI 4 de cry35. La utilidad de estas estrategias desarrolladas in silico se ha iniciado a comprobar experimentalmente, lo que nos da la posibilidad de su uso en estudios de tamizaje de colecciones de B. thuringiensis como fuentes de potencial genético.Bacillus thuringiensis con toxicidad para insectos coleópteros pertenecen a tres familias que son estructuralmente diferentes: las proteínas Cry, las Vip y las Sip. La importancia de su estudio se basa en que podrían ser empleadas como herramientas para incrementar la actividad tóxica de algunos insecticidas microbianos y combatir la resistencia. Teniendo en cuenta este planteo, emerge la necesidad de disponer de estrategias para identificar sus genes codificantes en B. thuringiensis, que posteriormente permitan el descubrimiento de variantes novedosas. Se diseñaron diversas estrategias basadas en amplificación génica (PCR) para detectar e identificar genes cry14, cry23, cry37 y sip1, PCR multiplex para cry34, y otras seguidas de un análisis de restricción (RFLP) para cry3, cry7, cry8, cry35, vip1 y vip2. Se diseñaron 23 cebadores específicos en base al análisis de regiones conservadas por alineamientos múltiples de sus secuencias de DNA disponibles a través del sitio “Bacillus thuringiensis toxin nomenclature” (http://www.lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/), empleando ClustalW (http://www.ebi.ac.uk/clustalw/) y Oligoanalyzer 3.0 (http://scitools.idtdna.com/scitools/Applications/OligoAnalyzer/). Los fragmentos de DNAesperados son de alrededor de 820 pb para cry3, 434 pb para cry7, 930 pb para cry8, 394 pb para cry14, 702 pb para cry23, 156 pb para cry34A, 274 pb para cry34B, 290 pb para cry35, 330 pb para cry37, 530 pb para vip1, 826 pb para vip2 y 1103 pb para sip1. Los fragmentos de aquellos genes por los que se optó por posterior RFLP fueron digeridos in silico empleando el software Restriction Mapper (http://www.restrictionmapper.org/ ). Mediante el uso de la enzima HinfI se podrían distinguir 4 subclases de genes cry3 y 11 de cry8, con TaqI+RsaI 4 de cry7, y con RsaI 4 de cry35. La utilidad de estas estrategias desarrolladas in silico se ha iniciado a comprobar experimentalmente, lo que nos da la posibilidad de su uso en estudios de tamizaje de colecciones de B. thuringiensis como fuentes de potencial genético.