Selección de variantes hiperproductoras de proteínas insecticidas de Bacillus thuringiensis INTA Mo4-4 destinadas al control de Alphitobius diaperinus

ORTIZ, M.; NAVAS, L.; AMADÍO, A.; PEREZ, M.; PEDARROS, A.; SAUKA, D., BENINTENDE, G.; ZANDOMENI, R.; BERRETTA, M.; ONCO, M.; BENINTENDE, G.; SAUKA, D.

Buenos Aires

Congreso; XV Congreso Argentino de Microbiologia (CAM 2019); V Congreso Argentino de Microbiologia de Alimentos (CAMA); V Congreso Latinoamericano de Microbiologia de Medicamentos y Cosmeticos (CLAMME); XIV Congreso Argentino de Microbiologia General (SAMIGE); 2019

Asociacion Argentina de Microbiologia

Introducción y Objetivos: Alphitobius diaperinus (Coleoptera:Tenebrionidae) afecta instalaciones avícolas basándose su control principalmente en el uso de productos químicos. Una estrategia ambientalmente mas segura podría incluir el uso de bioinsecticidas que contengan a Bacillus thuringiensis como ingrediente activo. Recientemente, la cepa nativa INTA Mo4-4 fue seleccionada por la alta virulencia de sus cristales como candidata para elaborar un bioinsecticida destinado al manejo de A. diaperinus. A nivel industrial y a efectos de reducir costos de producción, es necesario maximizarla obtención de biomasa activa (espora y cristales proteicos). El objetivo de este trabajo fue seleccionar variantes que produzcan concentraciones de proteínas insecticidas mayores que la cepa silvestre mediante mutagénesis inducida al azar. Materiales y Métodos: En una primera etapa se determino la concentración de dos agentes mutagénicos químicos que permitieran obtener menos del 2% de sobrevivientes. Para ello, células vegetativas y esporas (ca. 1x108UFC/ml) se expusieron por 16 h a diferentes concentraciones de naranja de acridina (NA) (25 a 100 ug/ml) y etil metano sulfonato (EMS) (3 a 6 ug/ml) respectivamente. A continuación, se realizo el ensayo de mutagénesis propiamente dicho utilizando 100 y 6 ug/ml de NA y EMS respectivamente. Las mutantes obtenidas se cultivaron en agar LB y las distintas colonias aisladasfueron repicadas a caldo de esporulación. Luego las proteínas totales solubilizadas fueron cuantificadas mediante el método de Bradford. Resultados: Se analizaron entre 100 y 200 colonias por tratamiento. Se selecciono una colonia (33) expuesta a NA y tres (28, 30 y 113)a EMS, que presentaron un porcentaje de producción de proteínas totales mayoral 20% que la cepa silvestre. Estas colonias se cultivaron sucesivamente en 1, 50 y 400 ml de caldo de esporulación y se cuantificaron las proteínas totales. La hiperproduccion se mantuvo estable en todos los casos, excepto para la colonia 33, hasta un volumen de 50 ml. Una alícuota del cultivo de las colonias 28, 30 y 113 obtenidas en este volumen se evaluaron toxicológicamente frente alarvas de A. diaperinus produciendo mortalidades entre 20 y 70% mas que la cepa silvestre (46,6 +- 3,3%). Finalmente, a una parte de la biomasa de estas colonias obtenida del cultivo de 400 ml se le cuantifico proteínas totales obteniendo entre un 48 y 91 % de mejoramiento con respecto a la cepa silvestre (333 +- 20 ug/ml). Estos valores tuvieron cierta correlación con las concentraciones de Cry3 obtenidas mediante densitometría de las bandas obtenidas en geles de SDS-Page, confirmando la hiperproduccion de la misma. Conclusiones: En conclusi¨®n, las mutantes seleccionadasexpuestas a EMS resultaron ser hiperproductoras estables de prote¨ªnasinsecticidas, traduci¨¦ndose en un aumento de la actividad t¨®xica. De este modo,se podr¨ªa mejorar el rendimiento de la producci¨®n de biomasa activa de INTAMo4-4 para el desarrollo de un futuro bioinsecticida.