Clonado y expresión de un gen cry1Ac en una cepa acristalífera de Bacillus thuringiensis

, M.; SAUKA, D.; PÉREZ, M.; PEDARROS, A.; BERRETTA, M.; BENINTENDE, G.

Rosario

Congreso; XXIII Congreso Latinoamericano de Microbiología y XIV Congreso Argentino de Microbiología; 2016

AAM

Bacillus thuringiensis es una bacteria gram positiva que durante la esporulación produce cristales, constituidos por proteínas Cry y/o Cyt, tóxicos para insectos. Las proteínas Cry se clasifican en 74 grupos en base a la similitud de sus secuencias aminoacídicas. En particular, las Cry1A son muy importantes debido a su amplia distribución en B. thuringiensis y a la alta toxicidad para lepidópteros. Los genes de la subclase cry1Ac han sido de los más introducidos en especies vegetales convirtiéndolas en "plantas Bt" resistentes a insectos. Debido a que los cristales de las cepas silvestres contienen en general más de una proteína insecticida, es de interés en muchos casos conocer la toxicidad de cada una para una determinada plaga. Para ello, es necesario clonar cada gen de interés y expresarlo individualmente (por ej. en Escherichia coli o en cepas de B. thuringiensis acristalíferas). En este estudio se planteó amplificar, clonar y expresar el gen cry1Ac de la cepa HD-73 perteneciente al serovar kurstaki en una cepa no productora de cristales. El gen cry1Ac se amplificó por PCR con un par de cebadores específicos conteniendo en sus extremos sitios de restricción. Estos permiten el clonado correcto del gen en el vector plasmídico pSVP27A bajo el control del promotor dependiente de esporulación pCYT. Este vector tiene capacidad para replicar en E. coli y B. thuringiensis. La reacción de ligación se utilizó para transformar la cepa XL-1 de E. coli. Luego se realizó una "colony PCR" con cebadores del vector para detectar los clones recombinantes y se corroboró la correcta inserción del gen mediante secuenciación. El plásmido recombinante se utilizó para transformar por electroporación la cepa acristalífera 4Q7 de B. thuringiensis. Los clones obtenidos que expresaron Cry1Ac fueron identificados por la presencia de cristales mediante microscopía de contraste de fases. El análisis de los mismos mediante SDS-PAGE reveló una banda esperada de ca.130 kDa. Se detectó la presencia de cry1Ac mediante amplificación específica de un fragmento del gen, y se corroboró el tamaño adecuado del inserto con cebadores del plásmido. Finalmente se evaluó la toxicidad de una suspensión espora:cristal (cc. final 50 µg/ml) para larvas neonatas de Spodoptera frugiperda. Se obtuvo una baja mortalidad del 11,1±5,0% en las condiciones ensayadas, pero una reducción muy significativa en el peso de las larvas (p < 0,005) en comparación con el control. En conclusión, se logró el clonado y expresión del gen cry1Ac de la cepa HD-73 en una cepa acristalífera. La toxicidad de Cry1Ac será ensayada in vitro contra larvas de diversos lepidópteros, así como sus posibles interacciones con otras proteínas que puedan obtenerse mediante una estrategia similar a la descripta en este trabajo.