Clonado y expresión de genes cry bajo el control de un promotor dependiente de esporulación en una cepa acristalífera de Bacillus thuringiensis

ONCO, M.; SAUKA, D.; BERRETTA, M.; PÉREZ, M.; LÓPEZ, N.; BENINTENDE, G.

Mar del Plata

Congreso; IV Congreso Argentino de Microbiología Agrícola y Ambiental y I Jornada de Microbiología General; 2018

Asociacion Argentina de Microbiologia

Bacillus thuringiensis se caracteriza por producir cristalesconstituidos por diversas proteínas Cry durante la fase de esporulación que son tóxicos para insectos. Ya que es de interés conocer la toxicidad de cada proteína cristalina para una determinada plaga, es necesario en principio clonar sus genes respectivos y expresarlos individualmente. En este estudio se planteó el clonado y expresión de los genes cry1Aa, cry1Ab, cry1Ac, cry2Aa y cry2Ab de las cepas INTA TA21-2, INTA H48-5, HD-73 svar. kurstaki, INTA H42-1 e INTA TA24-6 respectivamente, en la cepa acristalífera de B. thuringiensis 4Q7. Se amplificó mediante hot start PCR el marco de lectura abierta de dichos genes utilizando un par de cebadores que contienen en sus extremos sitios de restricción para el clonado correcto en el vector plasmídico pSVP27, que puede replicar tanto en Escherichia coli como en B. thuringiensis. Los amplicones generados y el vector fueron digeridos con BamHI y SphI para permitir la ligación. Se transformaron los productos de la ligación por electroporación en la cepa XL-1 de E. coli. Seguidamente se extrajo el DNA plasmídico de los clones recombinantes y se transformó en 4Q7. La identidad de cada gen cry clonado se corroboró mediante PCR con cebadores específicos para cada gen y del vector, y secuenciación de sus amplicones. Se analizó la expresión mediante microscopía óptica de contraste de fases en cultivos completamente esporulados de los clones seleccionados, identificándose la presencia de cristales libres muy pequeños. No se detectaron en geles SDS-PAGE las bandas esperadas de ca. 130 o 65 kDa correspondientes a Cry1 y Cry2 respectivamente, con excepción del clon que expresa Cry1Ac. Finalmente se evaluó la toxicidad de los clones recombinantes obtenidos para larvas neonatas del lepidóptero Cydia pomonella mediante bioensayos de incorporación en dieta (1000 μg biomasa seca/ml de dieta). Además se determinó la patogenicidad para larvas de Aedes aegypti de los clones transformados con cry2Aa. Los clones estudiados fueron responsables de altos porcentajes de mortalidad, con excepción de los transformados con cry2Ab. En conclusión, se consolidó en el laboratorio una estrategia para el clonado y expresión de genes cry en B. thuringiensis. Los clones recombinantes obtenidos podrían ser empleados para seleccionar proteínas Cry con alta toxicidad para insectos en los que no se conoce su grado de virulencia.