Prospección de genes insecticidas de cepas nativas de Bacillus thuringiensis mediante secuenciación de nueva generación (NGS). Caracterización y análisis funcional de una nueva proteína Cry

ORTIZ, M.; NAVAS, L.; AMADÍO, A.; PEREZ, M.; PEDARROS, A.; SAUKA, D., BENINTENDE, G.; ZANDOMENI, R.; BERRETTA, M.

Rosario

Congreso; XXIII Congreso Latinoamericano de Microbiología y XIV Congreso Argentino de Microbiología; 2016

AAM

Bacillus thuringiensis se caracteriza por la formación de cristales proteicos parasporales con actividad tóxica contra diversos insectos. Dentro de un grupo variado de factores de virulencia predominan las proteínas insecticidas Cry, Cyt y Vip, que poseen un espectro de acción específico sobre especies de distintos órdenes de insectos.En este trabajo se presenta la secuenciación del ADN plasmídico de 4 cepas nativas de la colección del IMyZA-INTA, previamente caracterizadas fenotípicamente y con información parcial sobre el contenido de sus genes insecticidas Se secuenció una biblioteca shotgun, construida con una mezcla de ADN plasmídico fragmentado a 500 nucleótidos promedio, utilizando una plataforma NGS Illumina-Miseq. Se obtuvieron 2.483.869 lecturas provenientes de una corrida 2x300 pb.Las lecturas se ensamblaron de novo con el programa A5-Miseq, el cual considera las distintas coberturas en el ensamblado de plásmidos con diferente número de copias. Los 2834 contigs resultantes tuvieron un tamaño comprendido entre 1 y 95 kb. Se definieron los marcos abiertos de lectura (ORF) mayores a 100 aminoácidos mediante la herramienta de anotación Artemis. Las secuencias aminoacídicas de los ORFs se analizaron mediante la herramienta online Bt Toxin Scanner para la identificación de las potenciales proteínas insecticidas. Se identificaron 8 proteínas Cry, 4 Cyt y 5 Vip, cinco de estas representarían nuevas proteínas insecticidas debido a su baja homología con las secuencias de toxinas depositadas actualmente en bases de datos. Se amplificó y clonó una de estas secuencias, incluyendo sus regiones promotoras y terminadoras, en el vector pHT3101 y se determinó su expresión en la cepa acristalífera de B. thuringiensis 4Q7.Se observó la formación de pequeños cristales esféricos parasporales en la cepa transformada, pudiendo confirmar la expresión de una proteína de 55 kDa por SDS-PAGE, coincidente con el tamaño estimado para el ORF de la correspondiente proteína Cry. Esta proteína presenta la mayor identidad con Cry36, una toxina con actividad coleoptericida entre todas las toxinas reportadas en la base de datos de B. thuringiensis. La baja identidad de solo 40% indicaría la presencia de una nueva categoría de proteína Cry de acuerdo con el sistema de clasificación vigente. De manera preliminar, se evaluó su actividad insecticida contra larvas de picudo del algodonero (Anthonomus grandis) y el escarabajo de la cama de pollo (Alphitobius diaperinus), no detectándose mortalidad significativa; restando un análisis exhaustivo de su actividad tóxica contra otras larvas de insectos plaga de interés.La determinación del contenido total de genes insecticidas de múltiples cepas de B. thuringiensis mediante secuenciación NGS, la identificación de cinco nuevas proteínas insecticidas y el análisis funcional de una de ellas, permite ampliar el número de genes provenientes de cepas nativas con potencial uso en el control de insectos plaga.