Rápida predicción de la producción de b-exotoxina de tipo I en Bacillus thuringiensis mediante amplificación génica

DIEGO SAUKA; MARIA ONCO; MELISA PEREZ; NANCI LOPEZ; MARCELO BERRETTA; GRACIELA BENINTENDE

Cordoba

Jornada; XV Jornadas Argentinas de Microbiología.; 2014

Asociación Argentina de Microbiología

La bacteria entomopatógena Bacillus thuringiensis radica su capacidad toxica en inclusiones cristalinas proteicas que sintetiza durante la esporulación y en otros factores de virulencia que produce durante su crecimiento vegetativo. Algunas cepas pueden secretar b-exotoxina de tipo I, un metabolito termoestable con actividad toxica inespecífica para un rango amplio de especies de insectos. También es tóxico para células de mamíferos y persiste por largo tiempo en el ambiente. El empleo de cepas de B. thuringiensis productoras de este metabolito como ingrediente activo de bioinsecticidas está prohibido en algunos países, entre ellos Argentina. Su detección se realiza tradicionalmente a través de bioensayos con Musca domestica y/o HPLC. Estos métodos tienen en común que son laboriosos y consumen mucho tiempo de trabajo. En ese sentido, creemos que suena imperativo disponer de un método de predicción de la producción de b-exotoxina de tipo I en B. thuringiensis que sea rápido y sencillo. El objetivo de este estudio fue establecer un método de PCR para la detección de un gen asociado a la síntesis dicho metabolito. Se diseñó un par de cebadores específicos empleando un software online (Oligoanalyzer 3.1), que amplifica un fragmento de 406 pb del gen thuE. Estos generaron productos de amplificación en 13,3% (4/30) de las cepas exóticas, y en 3,7% (4/107) de las nativas sugiriendo la posibilidad de que sean productoras de dicho metabolito. La cepa HD-1 utilizada como control negativo, no produjo amplificación. Para confirmar la especificidad de las reacciones, los productos de PCR positivos fueron purificados, secuenciados y analizados utilizando BLAST. Los resultados confirmaron la especificidad de la amplificación. La información obtenida por PCR se correlacionó con la de bioensayos con M. domestica con el fin de validar la técnica. Las cuatro cepas exóticas y las cuatro nativas que albergan el gen thuE mostraron también producir b-exotoxina. Además, las cepas exóticas 4K1 del serovar morrisoni y HD-542 del serovar thompsoni que habían dado negativo por PCR, resultaron positivas mediante bioensayos con M. domestica. La toxicidad de la cepa 4K1 se sabe que es debida a una b-exotoxina de tipo II. Pensamos que este compuesto podría ser también responsable de la toxicidad en HD-542. La producción de esta toxina no puede ser predicha por nuestro método de PCR, ya que las cepas productoras de b-exotoxina de tipo II carecerían del gen thuE. Esta b-exotoxina estaría codificada por otros genes diferentes a los requeridos para la biosíntesis de la de tipo I. En conclusión, se demuestra que esta metodología constituye un ensayo útil para la predicción de la producción de b-exotoxina de tipo I en B. thuringiensis. La misma se podría utilizar como primera aproximación en el tamizaje de cepas productoras de b-exotoxina en colecciones de B. thuringiensis, o en cepas puntuales que quieran destinarse a la formulación de bioinsecticidas.