Evolución dirigida de toxinas de Bacillus thuringiensis para aumentar la afinidad de unión a receptores del intestino del picudo del algodonero (Anthonomus grandis) mediante la técnica de phage display

PÉREZ, M.; SAUKA, D.; BENINTENDE, G.; BERRETTA, M.

Buenos Aires

Simposio; XIII Simposio REDBIO Argentina 2021 VIRTUAL; 2021

REDBIO Argentina

El cultivo de algodón es perjudicado por diversas plagas, siendo el picudo delalgodonero, Anthonomus grandis B. (Coleoptera: Curculionidae), uno de los insectos quemayores daños provoca en Argentina. Su control está asociado principalmente al uso deinsecticidas químicos, por lo cual la utilización de genes insecticidas de la bacteriaentomopatógena Bacillus thuringiensis para la generación de una variedad transgénicaresistente a la plaga, podría constituir una alternativa de control ambientalmentesostenible. En trabajos previos se ha observado que A. grandis presenta bajasusceptibilidad a toxinas Cry nativas producidas por B. thuringiensis. Para incrementarsu toxicidad contra larvas del picudo se propone modificar dichas proteínas medianteevolución dirigida. La estrategia utilizada en este trabajo se centra en la utilización deuna biblioteca de péptidos de secuencia arbitraria expresada en fagos, para seleccionarpéptidos con capacidad de unirse a receptores de proteínas Cry en el intestino de A.grandis. Los péptidos seleccionados serán utilizados para modificar secuencias quecorresponden a loops en la estructura de toxinas Cry nativas de tres dominios, queparticipan en la unión al receptor, y determinan su especificidad. En otros casos, se hareportado que el aumento de la capacidad de unión de proteínas Cry a sus receptores,determina un incremento de su toxicidad.La tecnología de expresión en fagos (phage display) aplicada a péptidos, consiste en laexpresión de un péptido en la superficie de un fago, mediante la fusión de la secuencianucleotídica que codifica para el péptido a expresar con el gen de una proteína decubierta del fago. Mediante un screening basado en un proceso de selección por afinidaddenominado ?biopaneo?, la población de fagos que expresan una biblioteca de péptidosde secuencia arbitraria, es enfrentada al blanco de interés a fin de capturarselectivamente los fagos de unión específica. En este trabajo se muestran resultadosparciales del biopaneo de una biblioteca comercial de péptidos, fusionados en posiciónN-terminal a la proteína pIII de la cápside de un fago derivado del M13, contra vesículasde membrana del intestino (BBMVs) de larvas del picudo. Para la primera ronda debiopaneo, las BBMVs (20 μg de proteína) se enfrentaron al pool de fagos (10E11 pfu), yluego de sucesivos lavados, los fagos unidos fueron eluídos y amplificados medianteinfección de la cepa ER2738 de E. coli. El stock resultante fue titulado para continuar consucesivas rondas de biopaneo. Se recuperaron varios clones, los cuales fueronsecuenciados. Para identificar clones que se amplifiquen selectivamente debido a suespecificidad de unión a receptores en las BBMVs, se analizarán clones aislados a partirde nuevas rondas de biopaneo. Los resultados obtenidos a partir de la optimización deesta metodología nos permitirán disponer de secuencias de péptidos candidato paramodificar la secuencia de proteínas Cry nativas.