Desarrollo de virus recombinantes para estudiar la entrada del Virus de la Diarrea Viral Bovina a la célula huésped

MERWAISS F; CZIBENER C.; ALVAREZ DE

Buenos Aires

Congreso; XI Congreso Argentino de Virología; 2015

Sociedad Científica Argentina

El virus de la dirrea viral bovina (BVDV) es un pestivirus patógeno del ganado vacuno cercanamente relacionado al virus de la hepatitis C dentro de la familia Flaviviridae de virus de RNA simple cadena de polaridad positiva. La cubierta del virus está compuesta por una membrana lipídica y las glicoproteínas estructurales E1 y E2 que median la entrada del virus a la célula huésped. La entrada de BVDV ha sido estudiada empleando métodos de virología tradicionales basados en la cuantificación de la unión del virus a la célula o de la susceptibilidad a la infección. De acuerdo con estos estudios, BVDV entra a la célula utilizando la endocitosis dependiente de clatrina mediada por la unión del virus a receptores específicos del huésped. La fusión de membranas permite que el virus libere el genoma de RNA al citoplasma para iniciar un ciclo de replicación. Distintos trabajos sugieren que la entrada de BVDV a la célula huésped requiere de la interacción del virus con receptores y co-receptores aún no identificados en una secuencia de pasos poco estudiados a nivel molecular. Nuestro objetivo es comprender cuáles son las interacciones huésped-patógeno que median la entrada de BVDV a la célula huésped. Utilizando genética inversa para manipular el genoma del virus desarrollamos nuevas herramientas que nos permitirán estudiar el detalle molecular del proceso de entrada. Se construyó el virus recombinante BVDV/BAP-E2, que expresa una versión de E2 fusionada en su extremo amino terminal al péptido aceptor de biotina (BAP) para permitir la marcación sitio específica de la partícula viral. Nuestros resultados indican que la fusión de BAP a E2 no interfiere con la función de la glicoproteína de envoltura. BAP es el sitio blanco para la unión de biotina mediada por la enzima biotin-ligasa BirA de Escherichia coli. La infección de células que expresan establemente BirA con BVDV/BAP-E2 permitirá recuperar del sobrenadante de infección partículas virales marcadas con biotina en su superficie. Esta estrategia de marcación puede usarse para unir sondas fluorescentes a E2 permitiendo seguir partículas virales individuales por microscopía de fluorescencia. Además se construyó el virus BVDV/GFP, que expresa la proteína verde fluorescente (GFP) en el contexto del genoma de RNA del virus. Con el fin de asegurar su correcto procesamiento, se insertó GFP fusionada en su extremo carboxilo terminal a la autoproteasa 2A del virus de aftosa (FMDV2A) entre la proteasa de BVDV Npro y la proteína de cápside C. Utilizando BVDV/GFP, pueden identificarse las células infectadas por el virus mediante la detección de GFP. Estos virus recombinantes servirán como herramientas para la caracterización de nuevos factores del huésped receptores y co-receptores de entrada de BVDV y para el estudio molecular de la interacción de partículas virales individuales con estos factores.