DISEÑO Y DESARROLLO DE UN KIT DE RT-PCR MULTIPLEX PARA LA DETECCIÓN DE GENES DE FUSIÓN FRECUENTES EN LEUCEMIA LINFOBLÁSTICA AGUDA

RUIZ, MARÍA SOL; LAGE-VICKERS, SOFIA; NUÑEZ, ANDREA; RICCHERI, CECILIA; GUERON, GERALDINE; COTIGNOLA, JAVIER

Mar del Plata

Congreso; XXVI Congreso Argentino de Hematología; 2023

Sociedad Argentina de Hematología

Introducción: En la actualidad los pacientes con Leucemia Linfoblástica Aguda (LLA) se agrupan en diferentes grupos de riesgo según parámetros bioquímicos, moleculares y citogenéticos. Entre las alteraciones genéticas más frecuentes, mejor caracterizadas y con buen poder pronóstico, se encuentran las translocaciones cromosómicas que generan genes de fusión. Por ejemplo, la presencia del transcripto de fusión BCR::ABL1 es de mal pronóstico, mientras que la fusión ETV6::RUNX1 es de buen pronóstico. Por esta razón, los protocolos clínicos ALL IC-BFM incluyen, de forma obligatoria, el estudio de los siguientes transcriptos de fusión con relevancia clínica confirmada: BCR::ABL1 p190 y p210, ETV6::RUNX1, KMT2A::AFF1, TCF3::HLF y P2RY8::CRLF2. Hoy en día, todos estos genes de fusión se estudian por RT-PCR (retrotranscripción-reacción en cadena de la polimerasa) en reacciones individuales realizadas en forma secuencial. Objetivo: Diseñar y desarrollar un ensayo de screening rápido y simple para la identificación de los genes de fusión más frecuentes en LLA mediante RT-PCR multiplex, la cual permite evaluar múltiples genes de fusión en un único tubo de reacción. Esta simplificación metodológica permitirá reducir los tiempos y costos de este estudio de tipo obligatorio en el protocolo ALL IC-BFM actual. Materiales y métodos: Se utilizó ARN purificado de muestras de médula ósea al diagnóstico de pacientes incluidos en el protocolo ALL IC-GATLA-2010, y se realizó una RT-PCR multiplex a punto final seguida de una electroforesis en geles de agarosa teñidos con bromuro de etidio.Resultados: El diseño de la reacción de RT-PCR nos permitió combinar 4 transcriptos de fusión en una reacción multiplex: BCR::ABL1 p190 y p210, ETV6::RUNX1 y P2RY8::CRLF2; las fusiones KMT2A::AFF1 no fueron incluidas por incompatibilidad de los tamaños de los fragmentos amplificados. Analizamos la performance de la reacción multiplex en muestras previamente caracterizadas, resultando en un 100% de concordancia. Además, se generaron controles positivos para los genes de fusión a través del clonado del ADNc proveniente de pacientes.Estimamos una reducción en el tiempo de entrega de resultados a 2-3 días; y una reducción en el costo de insumos a 1/7 del costo actual. Si bien este kit fue diseñado con el objetivo de optimizar el diagnóstico de las LLA pediátricas, la metodología tiene la potencialidad de poder ampliarse a otros tipos de leucemias en los que se requiera la identificación de transcriptos de fusión.Conclusiones: Logramos diseñar un estudio molecular de detección de genes de fusión recurrentes en LLA pediátrica, con la posibilidad de utilizarlo en otras patologías. La implementación de esta metodología permitirá reducir los tiempos de entrega de los resultados y los costos de los estudios, optimizando al mismo tiempo el uso de las muestras de los pacientes. Finalmente, se desarrollaron materiales de referencia para utilizar como controles positivos de reacción, que son de naturaleza ilimitada y eliminan la necesidad trabajar con productos de PCR de muestras de pacientes de disponibilidad limitada, y los cuales presentan un riesgo mayor de contaminación de la reacción.