Asesoria técnica: Efecto de oligoelementos y Lachesis muta en células malignas irradiadas.

ELENA S RIVERA; VANINA A MEDINA; MARIEL A NÚÑEZ; GABRIELA A MARTÍN; GRACIELA P CRICCO; COCCA CLAUDIA; ALICIA S GUTIÉRREZ; NORA A MOHAMAD; ROSA M BERGOC

2004-04-01

2004-06-30

Desarrollo de metodología

Salud humana

Objetivo: el efecto de oligoelementos y Lachesis muta sobre la radiosensibilidad de células malignas irradiadas Metodología: CULTIVO CELULAR Las líneas celulares mamarias humanas tumorales MCF-7, MDA-MB-231 (de American Type Culture Collection, ATCC) se cultivan en medio RPMI 1640 suplementado con suero fetal bovino (SFB) al 10%, glutamina 0,03%, fungizona 0,001% y gentamicina 0,004%. Se mantienen en estufa de cultivo a 370C en atmósfera humidificada con 5% de CO2. IRRADIACIÓN Y CURVAS DE SOBREVIDA Para determinar los parámetros de radiosensibilidad, las células se siembran (3300 células en botellas de 25 cm2) y se irradian y tratan 24 horas después cubriendo un rango de Dosis de 0 a 10 Gy, usando una fuente de 137Cs (tasa de dosis 7.7 Gy/minuto). Luego de 8 días las células se fijan, colorean con azul de Toluidina 1% y se evalúa la sobrevida mediante el recuento de colonias con más 50 células. Las curvas de sobrevida se ajustan al modelo matemático Lineal–Cuadrático, y se calculan los parámetros de radiosensibilidad α y β así como la Dosis para obtener una fracción de sobrevida de 10-2, y la sobrevida luego de una dosis de 2 Gy (SF2Gy) empleando la ecuación: SF= e - ( aD + bD2). SF (fracción de sobrevida): Número de colonias a Dosis D/ número de colonias a Dosis cero (sin irradiar). En este ensayo el número de colonias formadas define el número de células con capacidad clonogénica remanentes después de la irradiación con una Dosis de RI. Para realizar las irradiaciones es necesario contratar servicios de terceros, CEBIRSA S.A. (Equipo IBL 437C tipoH). La metodología propuesta es la de referencia para este tipo de estudios, por lo tanto no se sugiere otra alternativa. Estos ensayos presentan mucho error para Dosis altas, ya que el bajo valor en el recuento de colonias conlleva al aumento en el error de conteo, mientras que Dosis bajas implican tiempos de irradiación tan cortos que imposibilitan ajustar bien el valor de las mismas. Para disminuir estos errores se deben realizar los puntos experimentales por triplicado y ajustar las curvas a partir de 4 o 5 experimentos independientes.   DETERMINACIÓN DE LOS NIVELES INTRACELULARES DE ROS/RNS Las células se cultivan en monocapa, se irradian e inmediatamente después se incuban con diferentes colorantes fluorescentes: DCF (diacetato de diclorodihidrofluoresceína, sensible a peroxido de hidrógeno), HE (dihidroetidio, sensible a anión superóxido), DAF-2-DA (diacetato de diaminofluoresceína, sensible al óxido nítrico). Las células fluorescentes se analizan mediante citometría de flujo (FACScalibur Flow cytometer Becton Dickinson, CA USA), o microscopio de fluorescencia. La citometría de flujo requiere servicio de terceros (Hospital de Clínicas, Cátedra de Inmunogenética, Servicio de Citometría de flujo). Controles: autofluorescencia (sin colorantes), controles positivos como empleo de H2O2 o liberadores de NO. IRRADIACIÓN Y CURVAS DE SOBREVIDA Para determinar los parámetros de radiosensibilidad, las células se siembran (3300 células en botellas de 25 cm2) y se irradian y tratan 24 horas después cubriendo un rango de Dosis de 0 a 10 Gy, usando una fuente de 137Cs (tasa de dosis 7.7 Gy/minuto). Luego de 8 días las células se fijan, colorean con azul de Toluidina 1% y se evalúa la sobrevida mediante el recuento de colonias con más 50 células. Las curvas de sobrevida se ajustan al modelo matemático Lineal–Cuadrático, y se calculan los parámetros de radiosensibilidad α y β así como la Dosis para obtener una fracción de sobrevida de 10-2, y la sobrevida luego de una dosis de 2 Gy (SF2Gy) empleando la ecuación: SF= e - ( aD + bD2). SF (fracción de sobrevida): Número de colonias a Dosis D/ número de colonias a Dosis cero (sin irradiar). En este ensayo el número de colonias formadas define el número de células con capacidad clonogénica remanentes después de la irradiación con una Dosis de RI. Para realizar las irradiaciones es necesario contratar servicios de terceros, CEBIRSA S.A. (Equipo IBL 437C tipoH). La metodología propuesta es la de referencia para este tipo de estudios, por lo tanto no se sugiere otra alternativa. Estos ensayos presentan mucho error para Dosis altas, ya que el bajo valor en el recuento de colonias conlleva al aumento en el error de conteo, mientras que Dosis bajas implican tiempos de irradiación tan cortos que imposibilitan ajustar bien el valor de las mismas. Para disminuir estos errores se deben realizar los puntos experimentales por triplicado y ajustar las curvas a partir de 4 o 5 experimentos independientes.   DETERMINACIÓN DE LOS NIVELES INTRACELULARES DE ROS/RNS Las células se cultivan en monocapa, se irradian e inmediatamente después se incuban con diferentes colorantes fluorescentes: DCF (diacetato de diclorodihidrofluoresceína, sensible a peroxido de hidrógeno), HE (dihidroetidio, sensible a anión superóxido), DAF-2-DA (diacetato de diaminofluoresceína, sensible al óxido nítrico). Las células fluorescentes se analizan mediante citometría de flujo (FACScalibur Flow cytometer Becton Dickinson, CA USA), o microscopio de fluorescencia. La citometría de flujo requiere servicio de terceros (Hospital de Clínicas, Cátedra de Inmunogenética, Servicio de Citometría de flujo). Controles: autofluorescencia (sin colorantes), controles positivos como empleo de H2O2 o liberadores de NO.