Diseño de una estrategia antiviral contra el virus de la fiebre aftosa mediada por un microRNA artificial.

GISMONDI MI; ASURMENDI S; TABOGA OA

Huerta Grande

Encuentro; XXIX Reunión Científica Anual de la Sociedad Argentina de Virología; 2009

Sociedad Argentina de Virología

La fiebre aftosa afecta animales de pezuña partida y ocasiona graves consecuencias para el sector productivo. El agente etiológico es el virus de la fiebre aftosa (FMDV), un pequeño RNA virus que replica y se disemina rápidamente. Las vacunas actuales contra FMDV se basan en virus químicamente inactivado y son muy efectivas para el control y la erradicación de la enfermedad. Sin embargo, requieren al menos 7 días para generar una inmunidad detectable. Se ha propuesto el uso de la tecnología de interferencia de RNA (RNAi) para inhibir la replicación viral. La RNAi es un proceso de silenciamiento génico postranscripcional en eucariotas, en el cual intervienen pequeños RNA complementarios al gen silenciado, como los RNA pequeños interferentes (siRNA), originados por escisión enzimática a partir de moléculas de RNAdc, y los microRNA (miRNA), que se procesan a partir de precursores endógenos. Se demostró inhibición de la replicación de FMDV empleando dúplex de RNA complementarios a diferentes regiones del genoma viral, tanto en cultivos celulares como en cerdos y cobayos. El objetivo de este trabajo fue desarrollar una estrategia antiviral contra FMDV mediada por un miRNA artificial (amiRNA).Como blanco del amiRNA se seleccionó una región de 21 nt de la polimerasa de FMDV-A (3D1A). La secuencia del precursor del amiRNA complementario a 3D1A se clonó en el vector de expresión pcDNA6.2 (Invitrogen). Se transfectaron células BHK21 con el vector pcDNA6.2/premiRNA3D1A y se seleccionaron líneas celulares que expresan constitutivamente amiRNA3D1A. Éstas se clonaron por dilución límite y se seleccionaron las líneas BHK/3D1A/A5 y BHK/3D1A/E5. La expresión del amiRNA maduro en estas líneas celulares se confirmó por RT-PCR en tiempo real y secuenciación.Se cotransfectaron las células BHK/3D1A/A5 y BHK/3D1A/E5 con los plásmidos reporteros pcDNA6.2/RLUC/3D1A (que contiene la secuencia 3D1A río abajo de la Renilla luciferasa bajo el promotor de CMV) y pcDNA6.2/FLUC (que expresa la luciferasa de la luciérnaga) utilizando lípidos catiónicos. Como control de especificidad se utilizó el plásmido pcDNA6.2/RLUC/3D2A, en el que se reemplazó la secuencia 3D1A por otra secuencia de la polimerasa de FMDV. A las 24 hs postransfección se determinó la actividad de RLUC y FLUC en un lisado celular utilizando el sistema Dual Luciferase Reporter Assay System (Promega). La actividad de RLUC normalizada media fue significativamente menor en las células transfectadas con pcDNA6.2/RLUC/3D1A que en las células transfectadas con los plásmidos control (45,14% y 52,86% respecto de 100% para BHK/3D1A/A5 y BHK/3D1A/E5, respectivamente, p <0,0001).Se evaluó entonces el efecto de la expresión del amiRNA3D1A sobre la replicación de FMDV A2001. Las células BHK/3D1A/A5 fueron infectadas con FMDV A2001 (moi=5) y se cuantificó el número de genomas virales luego de la adsorción y a las 4 hpi mediante la técnica de RT-PCR en tiempo real. El número de genomas de FMDV se redujo en un 92% en las células amiRNA3D1A+ respecto de las células BHK21 a las 4 hpi (p<0,01). Los resultados obtenidos demuestran que la expresión constitutiva de un amiRNA no fue deletérea para el cultivo celular y establecen la prueba de concepto de que es posible emplear amiRNA como estrategia antiviral contra FMDV.