EFECTO DE LA EXPRESIÓN DE MÚLTIPLES MICROARN ARTIFICIALES SOBRE LA REPLICACIÓN DEL VIRUS DE LA FIEBRE AFTOSA

CURRÁ, A.P.; GISMONDI, M.I.; ASURMENDI, S.; TABOGA, O.

Buenos Aires

Congreso; XII Congreso Argentino de Virología; 2017

Sociedad Argentina de Virología

El virus de la fiebre aftosa (FMDV) produce una enfermedad altamentecontagiosa que afecta animales biungulados y que causa grandespérdidas económicas. Las vacunas actuales contra FMDV están basadasen virus inactivado químicamente y son muy efectivas para el control yla erradicación de la enfermedad, aunque presentan el riesgo deincorrecta inactivación o escape desde las plantas productoras. Por lotanto, resulta de interés desarrollar estrategias antivirales alternativas,entre las que se ha propuesto la tecnología de interferencia de ARN(ARNi).El objetivo de este trabajo fue evaluar el efecto de la expresión demúltiples microARN artificiales (amiR) dirigidos contra la región 3D de FMDV sobre la replicación viral. Esta región del genoma viral codificapara la ARN polimerasa ARN dependiente y se encuentra conservadaentre los siete serotipos de FMDV. Mediante algoritmos bioinformáticosse seleccionaron 3 secuencias blanco de 21 bases (290, 444, 1055) y seconstruyeron vectores de expresión de los amiR correspondientes, tantode manera individual como en tándem (1055-290, 1055-444). Laexpresión transitoria de los distintos amiR en células BHK-21 produjo elsilenciamiento del gen reportero GFP fusionado a la secuencia completade 3D a las 24 h postransfección, lo que demuestra su eficiente expresióny actividad de silenciamiento.Se establecieron líneas celulares policlonales que expresan los distintosamiR (de manera individual o en tándem). Las líneas celulares seinfectaron con FMDV A/Arg/01 (moi=0,001) y se cuantificó el viruspresente en el sobrenadante a las 48 horas postinfección (hpi) mediantetitulación a punto final. No se observaron diferencias en el título viralrespecto de una línea celular control que expresa un amiR norelacionado. En todas las líneas celulares obtenidas se evidenció un bajonivel de expresión de amiR mediante stem-loop qPCR.A fin de obtener una expresión homogénea del amiR correspondiente entodas las células del cultivo, se obtuvieron líneas celulares monoclonalesque expresan el amiR1055 mediante clonado por dilución límite. Estaslíneas celulares se infectaron con FMDV A/Arg/01 (moi=0,001) y sedeterminó el título viral en el sobrenadante a distintos tiempospostinfección. En 3 de 5 líneas celulares se evidenció una reducciónsignificativa del título viral a las 18 hpi; sin embargo, no hubo diferenciasa las 24 y 48 hpi. Se descartó la selección de mutantes de escape a las 48hpi mediante secuenciación de la región blanco del amiR en el viruspresente en el sobrenadante de infección. Nuevamente, los niveles deexpresión del amiR1055 fueron bajos, disminuyendo en pasajesconsecutivos.Estos resultados sugieren que la reducida actividad de silenciamiento deFMDV en líneas celulares establemente transformadas está vinculadacon la escasa expresión de los amiR correspondientes o,alternativamente, a una acotada accesibilidad de los amiR al genomaviral en el contexto de la infección.