Diseño y evaluación de una estrategia de silenciamiento del virus de la fiebreaftosa mediada por microRNA artificiales

GISMONDI MI; ASURMENDI S; TABOGA OA

Buenos Aires

Congreso; X Congreso Argentino de Virología; 2011

Sociedad Argentina de Virología

La fiebre aftosa es una enfermedad altamente contagiosa que afecta animales de pezuña partida, ocasionando importantes pérdidas económicas para el sector productivo. El agente etiológico es el virus de la fiebre aftosa (FMDV), formado por una cápside icosaédrica que contiene una hebra de RNA de polaridad positiva de alrededor de 8500 bases. Las vacunas actuales contra FMDV son efectivas pero requieren al menos 7 días para conferir protección. Entre las nuevas estrategias de control de FMDV se ha propuesto el uso de la interferencia de RNA, un mecanismo de silenciamiento génico postranscripcional específico de secuencia mediado por pequeñas moléculas de RNA complementarias a la secuencia que se desea silenciar. Entre ellas, los microRNA se procesan a partir de precursores endógenos en las células eucariotas. El objetivo de este trabajo fue diseñar y evaluar una estrategia antiviral contra FMDV mediada por microRNA artificiales (amiR).Se seleccionaron in silico tres regiones blanco en el genoma de FMDV-A, ubicadas en la región 3D (3D1 y 3D2) y en el extremo 3’no traducible (3UTR). La secuencia que codifica el precursor de cada uno de los amiR se clonó en el vector pcDNA6.2/GW/miR y los plásmidos obtenidos se transfectaron en células BHK-21. Se establecieron las siguientes líneas celulares monoclonales por dilución límite y selección con blasticidina: A5 y E5 (3D1+), E11 y H3 (3D2+) y C5 y D10 (3’UTR+). Se cotransfectaron distintos plásmidos Rluc (que contienen cada una de las secuencias blanco de los amiR río abajo de la Renilla luciferasa) y Fluc (que codifica la luciferasa de la luciérnaga) en las líneas celulares. Se determinó la actividad luciferasa (RLuc/Fluc) a las 24 h postransfección, observándose una reducción significativa de la misma en las líneas celulares A5 y E5 (2,14 y 2,67% vs. 100%, p:0,001) y E11 (43,96% vs 100%, p:0,001). No se observó silenciamiento de Rluc en las líneas celulares H3, C5 y D10.Con el objetivo de evaluar la actividad antiviral de las líneas celulares A5 y E5, éstas se infectaron con la cepa FMDV/A/Arg01 (moi= 5) y se cuantificó el número de partículas virales infectivas intracelulares y el RNA viral intracelular a 2, 4, 6, 7, 16 y 22 h postinfección mediante qPCR. La curva de crecimiento y la cinética de síntesis de RNA viral en las células A5 y E5 mostraron un perfil similar al obtenido en células BHK-21. Asimismo, la secuencia de la región blanco del amiR3D1A no presentó mutaciones respecto de la cepa A/Arg/01 a las 7 h postinfección, lo que indica que no se seleccionaron mutantes de escape que pudieran explicar la falta de silenciamiento.Los resultados obtenidos demuestran que la expresión del amiR3D1 no permite controlar la replicación de FMDV/A/Arg01 en células transgénicas, a pesar de ser funcional frente a un gen reportero. Futuros estudios acerca de la accesibilidad del genoma de FMDV permitirán establecer con mayor precisión cuáles son las regiones óptimas para ser utilizadas como blanco de silenciamiento.