Análisis filogenético de aislamientos del virus de hepatitis C no tipificables por RFLP.

GISMONDI MI; VALVA P; BECKER PD; GUZMÁN CA; PRECIADO MV

Buenos Aires

Congreso; VIII Congreso Argentino de Virología; 2005

Sociedad Argentina de Virología

El virus de hepatitis C (HCV) produce infecciones crónicas que pueden devenir en cirrosis y/o hepatocarcinoma. La determinación del genotipo viral cobra importancia para el pronóstico de la respuesta al tratamiento con interferón alfa (IFNa). Un método sencillo y económico para la tipificación del HCV es el polimorfismo de longitud de los fragmentos de restricción (RFLP), que permite clasificar a los aislamientos en 6 genotipos por medio de la digestión enzimática de amplicones de la región 5’UTR. Recientemente hemos demostrado la existencia de aislamientos de HCV con un patrón de restricción atípico provenientes de 4 pacientes pediátricos del Hospital de Niños Ricardo Gutiérrez. El objetivo de este trabajo fue determinar si dichos aislamientos corresponden a un nuevo subtipo viral circulante en nuestra región. Se analizaron muestras de plasma correspondientes a 8 pacientes (6 niños y 2 adultos) con infección crónica por HCV, que presentaban el citado patrón atípico de restricción. Se extrajo el ARN del plasma y se amplificaron por RT-PCR 251pb de la región 5’UTR, 810pb de la región Core-E2 y 379pb de la región NS5B, empleando una polimerasa con actividad exonucleasa 3’-5’. Los productos de amplificación fueron secuenciados y se analizaron las secuencias obtenidas utilizando criterios de distancia y de parsimonia. En todos los casos se detectó la presencia de una sustitución G®A en la posición -235 del genoma, correspondiente a la región 5’UTR. Dicha mutación genera un sitio de corte adicional para la enzima RsaI, empleada en la técnica de RFLP. Este nuevo sitio de corte es  el responsable de la observación del patrón de restricción atípico en estas muestras. Utilizando el criterio de distancia, se observó que tanto las secuencias de la región E1 completa (576pb) como las de una porción del gen NS5B (379pb) agruparon junto con la secuencia patrón de genotipo 1a, con alto soporte estadístico. Dentro de este cluster, el análisis de la región E1 presentó un agrupamiento más pequeño compuesto por secuencias con restricción atípica, que sin embargo no se reprodujo en su totalidad al utilizar la región NS5B. La reconstrucción filogenética de las muestras en estudio se realizó con el criterio de parsimonia, observándose un agrupamiento similar de las secuencias bajo estudio y los prototipos del genotipo 1. Los resultados de este trabajo indican que todos los aislamientos no tipificables analizados no corresponden a un nuevo subtipo viral sino que se encuadran dentro del genotipo 1 subtipo a del HCV.   Más aún aportan datos al concepto de diversificación regional del HCV que ha sido desarrollado por otros autores, algunas de cuyas muestras presentaron también el mencionado patrón de restricción atípico. El patrón de restricción atípico, por lo tanto, se propone como un patrón adicional que deberá ser tenido en cuenta en el diagnóstico del genotipo viral por RFLP en nuestra región.