Determinación de la estructura secundaria del elemento IRES de dos aislamientos del virus de la fiebre aftosa con distinto grado de virulencia

GISMONDI MI; GARCÍA NÚÑEZ S; TABOGA OA; CARRILLO E

Encuentro; XXXII Reunión Científica Anual de la Sociedad Argentina de Virología; 2012

La fiebre aftosa es una enfermedad muy contagiosa que afecta animales de pezuña hendida. Su propagación es rápida y las poblaciones ganaderas que la padecen disminuyen notablemente su productividad. El agente etiológico es el virus de la fiebre aftosa (VFA), perteneciente al género Aphtovirus dentro de la familia Picornaviridae. El ARN viral codifica para una única poliproteína cuya traducción está dirigida por un elemento IRES ubicado en la región 5’ no codificante. Durante los años 2000-2001 se describió la circulación de dos cepas de VFA de serotipo A (A/Arg/2000 y A/Arg/2001) en Argentina, las cuales presentaron distinto comportamiento clínico a campo y a escala de laboratorio. Estudios previos de nuestro laboratorio centrados en la identificación de los determinantes virales responsables de la virulencia diferencial observada entre ambas cepas de VFA permitieron postular al elemento IRES como una de las regiones candidato. El objetivo de este trabajo fue determinar experimentalmente la estructura secundaria del IRES de A/Arg/2000 y A/Arg/2001. Se aplicó la técnica de hSHAPE (high-throughput selective 2’ hydroxyl acylation analyzed by primer extension). Para ello, ambos IRES se transcribieron in vitro y el ARN purificado se plegó in vitro y se trató con NMIA (anhídrido del ácido N-metilisatoico), que modifica todos los nucleótidos no comprometidos en interacciones ARN:ARN. Dichas posiciones se detectaron mediante electroforesis capilar a partir de una reacción de retrotranscripción utilizando un oligonucleótido antisentido fluorescente. Los electroferogramas se analizaron con el programa ShapeFinder y los valores de reactividad hSHAPE se integraron para graficar la estructura secundaria de ambos IRES mediante el programa RNAstructure. Ambos IRES presentaron los dominios estructurales previamente descritos para VFA al tiempo que mostraron diverso grado de reactividad hSHAPE, observándose menor reactividad en el dominio 2 del IRES A/Arg/2001 respecto de A/Arg/2000. Las principales diferencias estructurales se presentaron en la región apical del dominio 3, que mostró mayor reactividad hSHAPE en los bucles 3b, 3c y 3d de A/Arg/2000. En particular, la mayor reactividad observada para el bucle 3c sugiere que la estructura de horquilla predicha para el IRES de la cepa A/Arg/2001 estaría ausente en A/Arg/2000. Por último, la estructura secundaria de los dominios 4 y 5 de ambas cepas de VFA fue similar. Las diferencias estructurales observadas en el dominio 3 podrían constituir un determinante viral de la virulencia diferencial de ambos aislamientos. En este sentido, dichas diferencias podrían afectar la estabilidad del elemento IRES en su conjunto, dado que se ha propuesto que el dominio 3 estaría involucrado en interacciones ARN:ARN intramoleculares. Asimismo, la conservación de la estructura secundaria de los dominios 4 y 5 sugiere que la funcionalidad del IRES no se ve afectada, dado que dichos dominios están directamente implicados en la interacción del ARN viral con los factores de inicio de la traducción.