Desarrollo de marcadores moleculares en base a estudios ómicos sobre dos progenitores de diferentes poblaciones base de un programa de mejoramiento genético de tomate

CACCHIARELLI, P.; ELIZABETH, TAPIA; GUILLERMO RAUL PRATTA

Zavalla

Jornada; Jornadas de Ciencia y Técnica de la Facultad de Ciencias Agrarias UNR, encuentro virtual; 2021

UNR

El tomate cultivado (Solanum lycopersicum) es una de las hortalizas de mayor importanciaagronómica (Meli et al., 2010). Dada su reducida variabilidad genética, en los programas demejoramiento suelen utilizarse especies silvestres emparentadas para ampliar la diversidaddisponible. A partir de experimentos previos, se logró obtener el genoma y transcriptoma de losprogenitores cv. Caimanta (S. lycopersicum, C) y LA0722 (S. pimpinellifolium, P), empleados paragenerar numerosas poblaciones del programa de mejoramiento genético de la Cátedra de Genética,FCA-UNR (Pereira da Costa et al., 2016). Estos genotipos discrepantes para caracteres de calidadde fruto, comenzaron a partir de los últimos 7 años a ser caracterizados mediante enfoques ómicos,evidenciando también un alto nivel de polimorfismo tanto en la composición de la secuencianucleotídica de su genoma como en el tipo y cantidad relativa de trancriptos detectados en tresestados madurez del fruto, obteniendo un listado de genes con expresión diferencial (ED)(Cacchiarelli et al., 2020a). A partir de esta lista de genes con ED, el estudio se enfocó en unasubfamilia de pequeñas proteínas de choque térmico (sHSP) localizada en el cromosoma 6 (Chr6) yaltamente expresada durante la madurez. De hecho, esta subfamilia de cuatro miembros representanaproximadamente el 57% del ARNm de sHSP total en frutos rojo maduros (Arce et al., 2019). Estos4 genes carecen de intrones y se encuentran duplicados en tándem dentro de una región de ~17,9 kbde Chr06. A partir de estos resultados en el nivel transcriptómico. se planteó como objetivo para elpresente trabajo el desarrollo de marcadores moleculares (MM) que permitan la caracterización deC, P y las diferentes poblaciones derivadas de su cruzamiento. Los genomas de estos progenitoresfueron obtenidos por Cambiaso et al. (2019a) y ya se han desarrollado MM estructurales secuencia-específicos (Cambiaso et al., 2019a y b, Cabodevila et al., 2021). Como aporte original de esteexperimento, es esperable que, al partir de datos transcriptómicos, los MM resulten funcionales.Para lograr el objetivo propuesto, se extrajeron las secuencias de ADN correspondientes a las 4sHSP mencionadas de los genomas de C y P. La comparación de estas regiones a través de unalineamiento de sus secuencias permitió poner de manifiesto numerosos polimorfismosnucleotídicos. Entre ellos, se detectaron in silico 3 Inserciones/Deleciones a partir de las cuales sedesarrollaron MM de tipo InDel, cuyo comportamiento esperado es herencia codominante. Paradicho desarrollo de cebadores que permitieran amplificar estos InDel, la comparación de lassecuencias se realizó en la plataforma online EMBOSS Needle(https://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_needle), seguido de Primer3 (https://primer3.ut.ee/) parasu obtención, considerando que los parámetros ?any_th?, ?3'_th? y ?hairpin? sean cercanos a 0, valorque indica alta calidad y especificidad. In silico, se identificaron: InDel#1 Cebador Izquierdo (CI):GATGTTCTGATGTCTGATGTAGTCT, Cebador Derecho (CD):TGATTCTATTATGTATAAAGTAGCAGAGG, amplicón de 402 bases, alinea con la regióncodificante de Solyc06g076550.4.1, diferencia de 14 pb entre C y P; InDel#2 CI:TTAAGCCAGCAAATTAAACAACTGT, CD: AAATAAGGTTTTCATGTTTAGCCCT,amplicón de 336 bases, alinea con la región promotora de Solyc06g076570.4.1, diferencia de 8 pbentre C y P; InDel#3 CI: GGATGATGGTGTGTAAGAATGATGA, CD:GTAAGCCTGCGAAGTTGAAATAATG, amplicón de 559 bases, alinea con la región promotorade Solyc06g076570.4.1, diferencia de 16 pb entre C y P. Estos 3 InDel fueron validados medianteamplificaciones por PCR que incluyeron, además del ADN extraído de plantas de C y P, al de las F 1recíprocas entre ellos a fin de verificar el comportamiento codominante esperado en su herencia.Los amplicones fueron visualizadas en geles de agarosa al 2,5% p/v en corridas electroforéticas conbuffer TAE en concentración de 1x y visualización mediante tinción con SYBR® Safe. Comopuede observarse en la Fig. 1, para el InDel 1 se visualizaron las bandas esperadas tanto en C y Paunque las F 1 no mostraron un patrón de herencia codominante sino un único amplicón de igualtamaño que el de C. Por su parte, los InDel 2 y 3 sólo amplificaron en C y en las F 1 , por lo que enlos tres casos la herencia resultó dominante, presentando P las alternativas recesivas de los 3 InDel.Cabe aclarar que la condición heterocigota de las F 1 había sido verificada previamente con otrosMM por Cabodevila et al. (2021), y que a pesar de este comportamiento dominante no esperado, eluso de los 3 InDel para caracterizar poblaciones segregantes no impide su uso sino que a lo sumosólo condiciona su análisis al de MM de naturaleza dominante. Estudios previos en esta región delChr6 demostraron que contiene secuencias altamente variables en el número y disposición de susgenes, en particular en las accesiones silvestres de tomate, lo que podría explicar la herenciadominante observada. La hipótesis subyacente es que en la condición heterocigota de loscruzamientos interespecíficos, los cebadores amplifican preferentemente sobre el genoma aportadopor el progenitor cultivado. Tal hipótesis puede sustentarse en que los genomas de C y P fueronalineados inicialmente como referencia a cv. Heinz 1706, un genotipo cultivado, lo que pudooriginar sesgos y/o forzar arreglos cromosómicos que resultan en artefactos en el genoma de P, talcomo Cacchiarelli et al. (2020b), demostraron para el análisis transcriptómico. En consecuencia, enel corto plazo se llevará a cabo una secuenciación de lectura larga en estos progenitores, con el finde revelar de manera más fiable la correcta disposición del arreglo de genes en dicha región delChr6. Como conclusión, a partir de estudios ómicos fue posible desarrollar y validar MMfuncionales de tipo InDel a partir de datos de dos progenitores de tomate.Fig.1: Geles de agarosa con visualización de bandas de los 3 InDels desarrollados amplificados en los genotipos de interés.Bibliografía:Arce D.P., Cacchiarelli​ P., Giménez​ M.D., ​Rodríguez​ G.R., Pratta G.R. (2019). Induccióndiferencial de HSPs evaluada por ARN-Seq en dos especies de tomate (​Solanum spp.) durante lamadurez del fruto. XVII Congreso Latinoamericano de Genética, Mendoza.Cabodevila V.G., Cambiaso V., Rodríguez G.R., Picardi L.A., Pratta G.R., Capel C., Lozano R.,Capel J. (2021). A segregating population from a tomato second cycle hybrid allows theidentification of novel QTL for fruit quality traits. Euphytica, 217(1), 1-14.Cacchiarelli P., Arce D.P., Tapia E., Pratta G.R. (2020a). Interactómica entre transcriptos en dosestados de madurez del fruto de dos genotipos de tomate (Solanum spp.) discrepantes para lacalidad. IV Reunión Conjunta de Sociedades de Biología de la República Argentina (virtual).Cacchiarelli P., Tapia E., Pratta G.R. (2020b). Ensamblado de novo del transcriptoma en tresestados de madurez del fruto de la accesión silvestre de tomate Solanum pimpinellifolium LA0722.XLVIII Congreso Argentino de Genética (virtual).Cambiaso V., Pratta G.R., Pereira da Costa J.H., Zorzoli R., Francis D.M., Rodríguez G.R. (2019a).Whole genome re-sequencing analysis of two tomato genotypes for polymorphism insight in clonedgenes and a genetic map construction. Scientia Horticulturae, 247, 58-66.Cambiaso V., Gimenez M.D., Pereira da Costa, J.H., Vazquez D.V., Picardi L.A., Pratta G.R.,Rodríguez G.R. (2019b). Selected genome regions for fruit weight and shelf life in tomato RILsdiscernible by markers based on genomic sequence information. Breed. Sci., 69, 447-454.Meli VS, Ghosh S, Parva TN, Chakraborty S and Datta A. 2010. Enhancement of fruit shelf life bysuppressing N-glycan processing enzymes. Proc Natl Acad Sci 107:2413-2418.Pereira da Costa J.H., Mahuad S.L., Liberatti D.R., Marchionni Basté, E.M., Rodríguez G.R.,Zorzoli R.; Picardi L.A., Pratta, G.R. 2016. Tomato Second Cycle Hybrids as a new source ofgenetic variability for fruit quality traits. Crop Breed. Appl. Biotech. 16: 289-297.