Análisis N-glicoproteómico de proteínas de interés industrial

GUSTAVO J. CAVALLERO; MALENA LANDONI ; ALICIA S. COUTO

CABA

Jornada; Jornadas de Bioquímica Industrial; 2019

Sociedad Argentina de Bioquímica

Introducción: La demanda de proteínas requeridas dentro del sector industrial alimentario está en aumento como consecuencia del desarrollo de nuevos productos. Principalmente, los ingredientes derivados de proteínas de huevo son los que se utilizan para respaldar el crecimiento del mercado de alimentos en forma de aditivos, no solo destinados al consumo humano sino también para animales. Las proteínas del huevo se distribuyen proporcionalmente entre la clara de huevo y la yema. Las principales proteínas de la clara de huevo, incluidas la ovoalbúmina, ovomucoide, ovomucina y la ovotransferrina, son glicoproteínas. La glicosilación es la modificación post-traduccional más frecuente en proteínas y los glicanos desempeñan un rol destacado en las funcionalidades asociadas en las glicoproteínas. Se encuentran vinculados a eventos de alergenicidad, en las propiedades antibacterianas y a la protección embrionaria, entre otros.Las proteínas de huevo se han estudiado utilizando diferentes enfoques tanto proteómicos como glicómicos, sin embargo, hasta la fecha no se ha informado ningún estudio detallado sobre glicopéptidos, a fin de recabar información estructural sobre los sitios de glicosilación conjuntamente con los glicanos que los modifican. En este contexto, el objetivo del presente trabajo es describir una metodología de análisis glicoproteómico completo para el total de las proteínas de clara de huevo en un intento por obtener información valiosa para una mejor comprensión de los atributos biológicos de las glicoproteínas que pueden conducir a nuevos métodos de procesamiento apropiados que consideren los efectos adversos para la salud y ampliar sus aplicaciones nutracéuticas en la industria alimentariaMateriales y métodos: Las proteínas de clara de huevo fueron extraídas por precipitación con ácido tricloroacético y la concentración de proteínas total se determinó por el método Bradford. Las proteínas fueron disueltas en buffer NH4HCO3 50mM. La muestra se redujo con 5mM DDT durante 30 min a 50°C, y se alquiló con 15mM IAA durante 30 min en la oscuridad a temperatura ambiente. La alquilación se cortó con 5mM DTT durante 15 min. Se añadió tripsina a la muestra con una proporción de proteína a tripsina de 100: 1. La incubación se realizó durante 16 h a 37ºC. La mezcla de péptidos después del tratamiento proteolítico se extrajo con 50% de ACN en NH4HCO3 50mM sonicando y luego llevado a seco. La muestra fue enriquecida en glicopéptidos mediante la técnica SPE Cotton-HILIC. Brevemente, se equilibraron los microtips HILIC-SPE con 83 % ACN. Luego de cargada la muestra, se eluyeron los péptidos no glicosilados con tres volúmenes de 85% ACN, TFA 0.5% TFA y los glicopéptidos retenidos se recuperaron posteriormente con tres volúmenes de agua. La fracción de glicopéptidos se liofilizó y se almacenó a -20 ° C hasta el análisis. Las muestras fueron analizadas en un nanoLC 1000 acoplado a un espectrómetro de masa EASYSPRAY Q Exactive (ThermoScientific) con analizador Orbitrap. Se utilizó la columna Easy Spray PepMap RSLC C18. La separación se logró con un gradiente lineal de 5% a 35% de solvente B en 75 min, a un flujo de 300 nL/min (fase móvil A: agua, ácido fórmico al 0,1%; fase móvil B: ACN a ácido fórmico al 0,1%). Los espectros MS2, se adquirieron en modo data-dependiente con un escaneo de los 15 picos principales en cada ciclo. La energía de colisión normalizada (NCE) se ajustó a 27. La temperatura de la fuente se ajustó a 175 ° C. La secuencia del proteoma se obtuvo de la base de datos UNIPROT. La identificación de proteínas se determinó mediante Proteome Discoverer 2.1 (Thermo Scientific). Las tolerancias de masa para MS y MS 2 fueron 10 ppm y 0.02 Da. La carbamidometilación de los residuos de cisteína se estableció como modificación estática y la oxidación de la metionina como modificación dinámica. La tolerancia en masa del ión precursor fue de 10 ppm y la tolerancia de la masa del fragmento fue de 20 ppm.La búsqueda de glicopéptidos se realizó mediante la herramienta de búsqueda automática, Byonic? (ProteinMetrics). Todas las identificaciones de glicopéptidos se curaron manualmente. Para la anotación manual, los datos se convirtieron en archivos de texto mediante la herramienta MS-Convert Tool (ProteoWizard).Resultados: Utilizando esta metodología, 34 proteínas pudieron ser detectadas, 18 de las cuales fueron identificadas como glicoproteínas. Fue interesante determinar 7 proteínas, que fueron reconocidas glicosiladas por primera vez, conjuntamente con la caracterización estructural de los glicanos que las modifican, lo que destaca este procedimiento incluso para el abordaje de proteínas de baja abundancia en muestras complejas. Es notable que las estructuras de glicanos encontradas en éstas últimas proteínas comparten motivos estructurales similares al conjunto de proteínas mayoritarias. Los resultados obtenidos con esta metodología concuerdan con los reportados por otros abordajes proteómicos, con la ventaja de obtener adicionalmente información estructural a nivel de glicopéptidos. Conclusión: Este estudio glicoproteómico permitió la determinación simultánea de péptidos modificados con N-glicanos y las glicoformas correspondientes, sobre la mezcla total de proteínas, en un único y rápido experimento de tres pasos. La información obtenida por este enfoque permitirá ampliar la comprensión de la bioactividad y de la alergenicidad derivadas de las glicoproteínas presentes en el huevo y ayudará a desarrollar nuevos métodos de procesamiento que monitoreen la calidad de las proteínas del huevo. Esta metodología, además, puede extenderse a otros sistemas dentro de la industria alimenticia.