Estudio estructural de la UDP-galactosilceramida transferasa de Trypanosoma cruzi

JULIANA E. PARENTE; MALENA LANDONI; VILMA DUSCHAK; ALICIA S. COUTO

Mendoza- Argentina

Congreso; XVII Simposio Nacional de química Orgánica; 2009

Soc. Argentina de Investigación en Química Orgánica

ESTUDIO ESTRUCTURAL DE LA UDP-GALACTOSILCERAMIDA TRANSFERASA DE TRYPANOSOMA CRUZI. Juliana E. Parente1; Malena Landoni1; Vilma Duschak2; Alicia S. Couto1. 1CIHIDECAR. Departamento de Química Orgánica. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires. CP 1428. 2Instituto Nacional de Parasitología, Dr. Fatala Chabén, Ministerio de Salud y Ambiente. CP 1063. Buenos Aires,  Argentina. E-mail: jparente@qo.fcen.uba.ar Las enzimas del metabolismo de los esfingolípidos se encuentran íntimamente relacionadas unas con otras generando una red interconectada que regula no solo los niveles de los lípidos bioactivos    individuales, sino también sus interconexiones metabólicas. En las células de mamífero, la mayoría de los productos han sido muy estudiados y muchas de las enzimas involucradas han sido bien caracterizadas, sin embargo, en protozoarios parásitos, es un área prácticamente desconocida. Por esta razón, toda información obtenida de la biosíntesis de esfingolípidos en T. cruzi  y sus diferencias con el mamífero hospedero ayudará a desarrollar nuevas estrategias quimioterapéuticas para el control de los parásitos y/o el tratamiento de los enfermos chagásicos. En este trabajo, fue detectada, purificada y parcialmente caracterizada, por primera vez, la UDP-Galactosilceramida transferasa (GCT). Esta enzima es clave en la biosíntesis de cerebrosidos, catalizando la transferencia de galactosa a partir de UDP-galactosa a ceramida dando galactosilceramida (GalCer) que actúa como precursor de glicolípidos simples, sulfátidos, galabiosilceramida y del gangliosido sialo-galceramida. La actividad enzimática se analizó in vitro utilizando el lisado total y la fracción microsomal pre-tratados con saponina y utilizando como sustrato un análogo de ceramida marcado con un grupo fluorescente (NBD) y UDP-galactosa como donor del azúcar. Luego de extracción y separación se detectó la síntesis de NBD-Galactosilceramida por CCD. Para determinar las condiciones óptimas de reacción se ensayaron diferentes condiciones variando el tiempo y la temperatura. Los mejores resultados se obtuvieron al incubar durante 30 minutos a 30ºC. Simultáneamente, se comparó la actividad enzimática en diferentes cepas del parásito encontrándose actividad en formas epimastigote de CL Brener y Tul-2 así como en las correspondientes fracciones enriquecidas en  membrana. Por otra parte, la enzima fue purificada y parcialmente caracterizada. La purificación  se inició con tres ciclos de congelado-descongelado, seguido de extracción con Sacarosa y KCl. La enzima pura fue obtenida luego de una cromatografía de afinidad a Concanavalina A seguida de una segunda cromatografía de afinidad a Cibacron Blue 3GA Agarosa. De esta forma, mediante un análisis por SDS-PAGE, se obtuvo una triple banda de PM aparente de 62-68 kDa, siendo la CGT de mielina de rata de 64 kDa. Estos resultados indicaron, además,  la presencia de cadenas glicosídicas de alta manosa como está descripto en la enzima de mamíferos. Con el objetivo de elucidar la estructura  de las cadenas de oligosacáridos presentes en la enzima, ésta fue tratada con PNGasa F y la fracción glicosídica se analizó mediante cromatografía de alta resolución de intercambio   aniónico (HPAE-PAD, sistema Dionex)  y espectrometría de masa UV-MALDI-TOF. La caracterización bioquímica y el análisis mediante espectrometría de masa UV-MALDI-TOF para la determinación de la secuencia de la proteína pura, se encuentran en desarrollo.