Estudio de la glicosilación de la pilina tipo IV de Xanthomonas citri subsp.citri.

A. S. COUTO; M. N. CABRINI; A. C. CASABUONO; S.PETROCELLI; E.G. ORELLANO

Rosario

Congreso; III Congreso Argentino de Espectrometría de masa; 2016

Sociedad Argentina de Espectrometría de Masa

Las pili tipo IV (Tfp) son adhesinas ampliamente distribuidas en la superficie de bacterias. En bacterias patógenas de plantas, las Tfp sido involucradas en los procesos de colonización, patogénesis y en una forma de traslocación celular independiente de flagelo, denominada movilidad tipo twitching. Estas propiedades hacen de Tfp un blanco interesante para la inhibición de patógenos. Xanthomonas citri subsp. citri (Xcc) es el fitopatógeno responsable de la cancrosis, una de las enfermedades más devastadora de los cítricos. En este trabajo, luego de la identificación de tres genes relacionados con la subunidad estructural Tfp en el genoma de Xcc: fimA, fimA1 y pilA, que presentan características distintivas no presentes en otras bacterias del género Xanthomonas y de la construcción de una mutante en el gen pilA (XccpilA), se realizó por primera vez un estudio de la glicosilación.Fracciones parcialmente purificadas de Tfp obtenidas de la cepa salvaje y de la mutante, fueron analizadas por SDS-PAGE mostrando en ambos casos una banda que se coloreaba fuertemente con ácido periódico-reactivo de Schiff (PAS) que indicaba su naturaleza glicoproteica. A fin de confirmarlo, la banda de gel correspondiente de cada cepa fue digerida con tripsina y la mezcla de péptidos fue hidrolizada con TFA 2 N. Cuando los azúcares componentes fueron analizados por cromatografía de intercambio aniónico con detector de pulso amperométrico (HPAEC-PAD), se observó que ambas cepas presentaban glucosa como componente mayoritario y manosa como minoritario. Además se observó un componente que correspondía a un producto de hidrólisis parcial. Dicho producto fue aislado y analizado por espectrometría de masa MALDI-TOF mostrando una estructura de tetrasacárido Hex4CH3 como [M + H]+. Con el fin de obtener más información, las bandas de gel correspondientes a la Tfp de Xcc cepa salvaje y XccΔpilA fueron sometidas a una -eliminación reductiva. Los oligosacáridos liberados fueron analizados por HPAEC-PAD observándose en ambas muestras, picos con tiempos de retención similares a maltitol, maltotriitol y maltotetraitol indicando la presencia de oligosacáridos compuestos por 2 a 4 unidades de hexosas.Por otra parte, las fracciones obtenidas por tripsinización de la banda de SDS-PAGE, fueron analizadas por e.m. en modo reflectrón positivo. No se detectaron diferencias entre los espectros de la fracción total de péptidos y una fracción de glicopéptidos obtenida luego de un paso de enriquecimiento utilizando extracción en fase sólida con cromatografía de interacción hidrofílica (HILIC-SPE), indicando que las pilinas de Xcc cepa salvaje y de XccΔpilA están altamente glicosiladas. Conociendo las secuencias de FimA, FimA1 y PilA fue posible asignar las señales de los espectros de ambas muestras con sus correspondientes glicopéptidos. Así fueron detectados iones atribuidos a glicopéptidos correspondientes a las diferentes fracciones de la glicoproteína, conteniendo unidades de hexosas y de hexosas metiladas. Se utilizó un análisis LID-MS/MS para confirmar dichas estructuras. Fue interesante que se detectaron glicopéptidos involucrando las secuencias de FimA y de FimA1. En el caso de las subunidades de pilinas, esta modificación postraduccional contribuye a la complejidad estructural y a la diversificación funcional de Tfp. Por otra parte, los resultados obtenidos del análisis proveen la primera evidencia experimental de que tanto la proteína FimA como FimA1 son componentes estructurales de Tfp.