Estudio de la glicosilación de proteínas recombinantes en Escherichia coli

MALENA LANDONI ; JOSEFINA CAILLAVA; ANDRÉS CIOCCHONI; ALICIA COUTO

virtual

Simposio; XXIII Simposio Nacional de Química Orgánica; 2021

SAIQO

En los últimos años, la glicoingeniería de bacterias, que combina el conocimiento de la glicobiología de las bacterias con la ingeniería genética, ha surgido como una alternativa viable para la producción de glicoproteínas que se emplean como agentes terapeúticos y vacunas. Sin embargo, esta tecnología requiere comprobar la correcta glicosilación de las mismas, para asegurar la obtención del producto deseado. La detección de los anticuerpos generados en respuesta a una infección es una herramienta útil para el diagnóstico temprano y seroespecífico de pacientes con síndrome urémico hemolítico. Sin embargo, la medición de estos anticuerpos, actualmente, se realiza empleando la bacteria completa o el lipopolisacárido (LPS) purificado que puede resultar en falsos positivos por la reactividad cruzada. Las glicoproteínas recombinantes que se intentan obtener mediante esta metodología constituirían una nueva generación de antígenos que no generen reactividad cruzada entre diferentes serotipos y que evitan la mayoría de las desventajas de los métodos químicos clásicos para la obtención de glicoconjugados, reduciendo los costos y mejorando la reproducibilidad de los productos. En este trabajo se realizó el estudio de la glicosilación en glicoproteínas recombinantes de cuatro diferentes serogrupos de Escherichi coli. El objetivo es obtener glicoproteínas que contengan el oligosacárido correspondiente al antígeno O del LPS. Las glicoproteínas fueron producidas en la E. coli empleando un sistema de N-glicosilación de Campylobacter jejunia. El sistema consiste en una oligosacariltransferasa (PglB) que transfiere oligosacáridos sintetizados sobre un lípido (Und-P) a una proteína blanco (AcrA) que tiene la secuencia consenso de N-glicosilación. El proceso de síntesis del oligosacárido sobre Und-P es equivalente a la síntesis del antígeno O, así, las glicoproteínas son producidas aprovechando toda la maquinaria de glicosilación de la bacteria. Las proteínas glicosiladas se purificaron por cromatografía de afinidad. Las glicoproteínas fueron digeridas con tripsina y los glicopéptidos fueron enriquecidos por micro-HILIC y analizados por nanoHPLC-ESI-Orbitrap. Los resultados fueron procesados manualmente para determinar las posibles glicosilaciones presentes.En todos los serogrupos estudiados fue posible determinar la presencia del péptido, conteniendo la secuencia consenso, glicosilado con las estructuras correspondientes a los antígenos O esperados. Para el serogrupo O111 se determinó la presencia de la proteína AcrA N-glicosilada con un glicano de estructura (didesoxihexosa)2(Hexosa)2(HexosaminaNAc) que coincide con la estructura descripta previamente para el antígeno O de dicho serogrupo: [-Colp(1->3)-Colp(1->6)]-D-Galp(1->3)-D-GlcpNAcb. Para el serotipo O45, se observó la presencia de una estructura glicosídica del tipo (hexosa)(desoxihexosa)(desoxihexosaminaNAc) en el sitio previsto de N-glicosilación consistente con la estructura previamente descriptac. El serotipo O26 presentó una estructura (hexosaminaNAc)(desoxihexosaminaNAc)(desoxihexosa) también en concordancia con la descripción previad. Finalmente, el serotipo O103 mostró una secuencia de (hexosaminaNAc)3(desoxihexosaminaN-hidroxibutiril)(hexosa) que se corresponde con la caracterización de bibliografía para si antígeno Oe.