INVESTIGADORES
ZURITA Maria Eugenia
congresos y reuniones científicas
Título:
DIAGNOSTICO MOLECULAR PARA COQUELUCHE EMPLEANDO UNA PLATAFORMA MULTIPLEX DE PCR EN TIEMPO REAL
Autor/es:
FLORES, DARIO; LARA, CLAUDIA; BOTTERO, DANIELA; FIORI, SILVANA; SORHOUET, C; RUGGERI, D; ZURITA, MARIA EUGENIA; GALAS, MARCELO; HOZBOR, DANIELA
Reunión:
Congreso; III CONGRESO NACIONAL DE REDES XV REUNION ANUAL DE REDES DE LABORATORIO; 2011
Resumen:
Introducción:Coqueluche o tos convulsa es una enfermedad respiratoria
altamente contagiosa que afecta tanto a niños como a adolescentes y adultos. Los
síntomas y signos característicos de la enfermedad son la tos, tos paroxística,
vómito postusivo, apneas y cianosis. Las manifestaciones más graves ocurren en
los niños menores de 6 meses de edad no inmunizados pudiéndoles ocasionar
incluso la muerte. En adolescentes y adultos, la enfermedad se presenta con un
cuadro clínico mas leve y en ocasiones puede manifestarse como una tos
persistente durante largos periodos de tiempo lo cual favorece la trasmisión del
patógeno hacia la población mas susceptible.El principal agente etiológico
de la enfermedad es Bordetella pertussis aunque otras especies del género como
B. parapertussis e incluso B. bronchiseptica pueden ocasionar una enfermedad con
sintomatología similar a pertussis. Recientemente se ha identificado a B.
holmesii en pacientes con cuadros respiratorios agudos.El diagnostico de
esta patología en el laboratorio se puede realizar mediante diferentes
metodologías las cuales requieren como muestra clínica sueros o secreciones
nasofaríngeas. Estas metodologías son:1- Serológica que evalúa títulos de
anticuerpos totales anti Bordetella a través de un ensayo de ELISA. La
plataforma hasta ahora empleada requiere de 2 muestras de sueros tomados con
diferencia de 21 días (correspondientes a fase aguda y fase convaleciente
respectivamente).2- Microbiológica, que consiste en el aislamiento del
agente causal en medios específicos. El diagnóstico microbiológico aunque de
baja sensibilidad es el gold standard.3- Molecular, que detecta
específicamente mediante ensayos basados en PCR la presencia en el paciente de
ADN del agente causal. Los ensayos de PCR pueden realizarse en formato
convencional o en tiempo real.Mediante estas metodologías el Laboratorio
Nacional de Referencia para Coqueluche de nuestro país (IBBM FCE UNLP - INEI
ANLIS Malbrán) contribuye a la detección del aumento sostenido de casos que
viene registrando el Ministerio de Salud de La Nación desde el año 2002.El
objetivo de este trabajo consistió en evaluar la capacidad diagnóstica de la PCR
en tiempo real en forma comparativa con la PCR convencional y en el contexto
clínico epidemiológico del paciente.Materiales y Métodos:Durante el
período septiembre del 2010 marzo del 2011, 89 muestras provenientes de
pacientes con sospecha clínica de coqueluche fueron analizadas mediante ensayos
de PCR convencional y PCR en tiempo real. El algoritmo seguido para el
diagnóstico molecular se presenta en la Figura 1. Los ensayos de PCR
convencional incluyen tres sets de primers, dos para las secuencia de inserción
IS481 e IS1001 y un tercero para el promotor de la toxina pertussis (PT). Estos
primers permiten identificar secuencias de ADN propias de B. pertussis, B.
parapertussis y Bordetella spp (Tabla 1 A).Para los ensayos de PCR en tiempo
real se emplea una plataforma multiplex la cual permite identificar además de B.
pertussis y B. parapertussis a B. holmesii (Tabla 1 A).Luego y en base a los
resultados que se obtengan y teniendo en cuenta los datos clínicos
epidemiológicos del paciente se realizará la clasificación y cierre del
caso.Resultados:De las 89 muestras obtenidas de pacientes con diagnóstico
clínico de coqueluche y analizadas en forma comparativa mediante los dos ensayos
de PCR (convencional y en tiempo real), 12 tuvieron un resultado positivo en la
PCR en tiempo real y las restantes 77 repitieron el resultado negativo obtenido
con la PCR convencional.De estas 12 muestras, 8 tuvieron un resultado
negativo en la PCR convencional que emplea tanto los primers de las secuencias
IS481 como con los de IS1001 y 4 tuvieron un resultado positivo en la PCR
convencional que emplea primers específicos de la secuencia de inserción IS481.
De estas 4 muestras, 2 se correspondieron a B. pertussis y 2 a B. holmesii en
los ensayos de PCR en tiempo real.La totalidad de los pacientes con
resultados positivos en el diagnóstico molecular eran menores de un año de edad
que presentaban al menos dos síntomas característicos de la enfermedad y con
esquema de vacunación completo en el 70% de los pacientes. De las 12 muestras
con resultado positivo en PCR en tiempo real, 10 fueron compatibles con ADN
específico de B. pertussis, amplificando las secuencias IS481 y PtxS1 y 2 de B.
holmesii, amplificando las secuencias IS481 e IS1001h.Conclusiones: Estos
resultados muestran a la PCR en tiempo real con una mayor capacidad diagnóstica
para coqueluche que la PCR convencional. Sin embargo es de destacar que la PCR
convencional en el algoritmo seguido por los laboratorios asociados a la red
representa una herramienta efectiva para el diagnostico oportuno de la
enfermedad. La aplicación de la nueva tecnología cobra mayor relevancia al
brindar la posibilidad de identificar diferentes especies de Bordetella en un
único ensayo multiplex.