Detection of riboflavin prduction by Lactobacillus plantarum strains during growth and its gastrointestinal survival

MOHEDANO, MARI LUZ; HERNANDEZ, S.; YEPEZ, A.; REQUENA, TERESA; MARTINEZ-CUESTA, S.; PALAEZ, C.; RUSSO, PASQUALE; LEBLANC, JEAN GUY; AZNAR, R.; LOPEZ, P.

Workshop; X Workshop de la Sociedad Española de Probióticos y Prebióticos; 2019

Algunas cepas de bacterias del ácido láctico (BAL) pueden producir riboflavina, una vitamina del complejo B soluble en agua, esencial para los seres humanos al ser un componente crucial para el metabolismo celular. En este trabajo, hemos evaluado la producción de riboflavina (vitamina B2) por cinco cepas de Lactobacillus plantarum aisladas de chicha, una bebida fermentada tradicional basada en maiz del noroeste de Argentina. Además, estas cepas fueron usadas para seleccionar mutantes hiperproductores de riboflavina por tratamiento con roseoflavina (análogo estructural de la riboflavina). Los mutantes contienen mutaciones puntuales en la región RFN (estructura pentafoliada) localizada entre el promotor y el primer gen del operon rib. El método habitual de evaluación de la producción bacteriana de riboflavina es por detección fluorescente de dicha vitamina después del fraccionamiento de las muestras por HPLC. En este trabajo, hemos estandarizado la utilización de un método de detección espectroscópica de fluorescencia directa para cuantificar la producción de riboflavina en sobrenadantes de cultivos bacterianos. La comparación de la eficiencia de la cuantificación de la riboflavina por fluorescencia con o sin el fraccionamiento previo por HPLC mostró que el método desarrollado es una prueba rápida y fácil para la selección de cepas productoras de vitamina B2. Además, el método aplicado a cultivos crecidos en medio definido, demostró ser útil para detectar la regulación de la producción de riboflavina en tiempo real. También se realizó un marcaje fluorescente de las estirpes por transferencia del plásmido pRCR12, que codifica la proteína fluorescente roja mCherry. El marcaje no afectó negativamente el crecimiento, la producción de riboflavina o la adhesión a superficies bióticas o abióoticas. Este marcaje fluorescente generó una herramienta atractiva para evaluar la supervivencia a las condiciones del tracto digestivo en: (i) presencia de microbiota empleando el modelo de intestino BFBL multicompartimental dinámico y (ii) para investigar la capacidad de adhesión de estas bacterias superproductoras de vitamina B2 a superficies bióticas en modelos in vivo (ratones) e in vitro (enterocitos humanos). Teniendo en cuenta las características biotecnológicas y la producción de riboflavina, se seleccionó la estirpe L. plantarum M5MA1-B2 sobreproductora de vitamina B2 para dichos estudios después de haber sido marcada fluorescentemente. Así, se evaluó la supervivencia de L. plantarum M5MA1-B2 [pRCR12] bajo estrés del tracto digestivo en presencia de microbiota en el modelo intestinal dinámico BFBL y (ii) en un modelo murino. Después de la exposición a ambos modelos, M5MA1-B2 [pRCR12] se recuperó e identificó y cuantificó por el color rosa de sus colonias. Los resultados indicaron una resistencia satisfactoria de la cepa a las condiciones de estrés gástrico e intestinal, pero se observó una baja capacidad de colonización tanto in vitro como in vivo. En general, L. plantarum M5MA1-B2 podría emplearse como una cepa probiótica para el desarrollo de alimentos funcionales.Este trabajo ha sido financiado por CYTED Proyecto estratégico: 917PTE0537y MICINN (proyectos PCIN-2017-075, PCIN-2017-003, AGL2016-75951-R y RTI2018-097114-B-I00)