Disrupción de la vía del Ergosterol y la resistencia a lisis por Complemento de Trypanosoma cruzi mediante mutagénesis dirigida a HMG-CoA y Calreticulina

SÁNCHEZ VALDEZ F, ; PÉREZ BRANDAN, C; ZAGO, MP; BASOMBRIO, MA

Encuentro; XXIV Reunión Científica Anual de la Sociedad Argentina de Protozoología SAP 2010; 2010

SAP

En el presente estudio trabajamos independientemente en la mutagénesis dirigida de dos genes de Trypanosoma cruzi que codifican proteínas fundamentales para la viabilidad y desarrollo del parásito y cuya importancia necesita ser comprobada en modelos in vitro e in vivo. La 3-Hydroxi-3-metil-glutaril-CoA reductasa (HMG-CoA), es una enzima involucrada en la síntesis de ácido mevalónico, sustrato para la síntesis de ergosterol. El ergosterol actúa como fluidificante de la membrana plasmática de T. cruzi y su ausencia en células animales lo convierte en un blanco fundamental para el desarrollo de drogas antiparasitarias. Por otro lado, el gen calreticulina de T. cruzi (TcCRT) codifica una proteína de superficie localizada en el sitio de emergencia del flagelo. TcCRT es un factor de virulencia y además un receptor de superficie capaz de asociarse a las moléculas del sistema del Complemento C1q. Esta unión resulta en la inhibición de la formación de C3/C5 convertasas y el complejo de ataque a membrana. De esta forma TcCRT impide la activación de la vía clásica del Complemento. Con el objeto de caracterizar in vitro e in vivo la actividad de TcHMG-CoA y TcCRT en T. cruzi, nos planteamos obtener parásitos en los cuales una o ambas copias de estos genes se encuentren delecionadas. Las construcciones fueron realizadas utilizando el Sistema Multisite Gateway de Invitrogen y se encuentran basadas en genes de resistencia a antibióticos flanqueados por las regiones no codificantes de estos genes. Una vez obtenidos los vectores y secuenciados, se amplificaron por PCR los insertos para obtener los fragmentos de recombinacion. Estos fragmentos fueron electroporados independientemente en epimastigotes de T. cruzi de dos cepas diferentes, la cepa virulenta Tulahuén y la cepa atenuada denominada TCC. Los cultivos fueron seleccionados con sus correspondientes antibióticos durante aproximadamente 4 semanas. Actualmente los cultivos electroporados con las construcciones dirigidas a HMG-CoA se encuentran bajo selección. En cuanto a TcCRT, se seleccionaron parásitos TCC resistentes a 300 ug/ml de Higromicina B. La deleción monoalélica de TcCRT fué caracterizada y corroborada mediante PCR con el empleo de primers específicos. Actualmente nos encontramos realizando la caracterización de clones individuales TCC crt+/- mediante Southern Blot con el empleo de sondas específicas. No obstante, esta población de parásitos TCC crt+/- fue sometida a una segunda electroporación con el objeto de delecionar el alelo restante del gen crt y obtener parasitos nulos para este gen. Actualmente estos parásitos se encuentran bajo selección. Una vez confirmada la obtención de clones mutantes TCC crt+/- o TCC crt-/- procederemos a realizar los ensayos de lisis por Complemento, curvas de crecimiento y diferenciación de epimastigotes a tripomastigotes.