Construcción de vectores gateway para la deleción dirigida del gen Calreticulina de Trypanosoma cruzi

SÁNCHEZ VALDEZ F; PÉREZ BRANDAN, C; ZAGO MP; BASOMBRÍO MA

Santa Fe, Argentina

Jornada; XXIII Reunión Científica Anual de la Sociedad Argentina de Protozoología SAP 2009; 2009

Sociedad Argentina de Protozoología

En Trypanosoma cruzi Calreticulina (CRT) es un gen de copia simple que codifica una proteína de unión a calcio altamente conservada y multifuncional. Ensayos in vitro demostraron que la forma de superficie de CRT une las porciones colágenas de la molécula de reconocimiento del sistema del Complemento vertebrado C1q. Esta unión resulta en la inhibición de la formación de C3/C5 convertasas y el complejo de ataque a membrana. De esta forma CRT impide la activación de la vía clásica del Complemento. Con el objeto de caracterizar la actividad de CRT in vivo nos planteamos obtener clones de mutantes nulas para este gen, en la cepa virulenta Tulahuén y la cepa atenuada TCC de Trypanosoma cruzi. La mutagénesis dirigida se realizará mediante recombinación homóloga por transfección estable de epimastigotes con construcciones desarrolladas utilizando el Sistema Multisite Gateway (MSGW). Con el fin de poder emplear una única construcción para delecionar CRT en las diferentes cepas de T. cruzi planteadas, realizamos el análisis de sus secuencias 5´ y 3´ UTR. El análisis de los datos a partir de la comparación de secuencias con la publicada para la cepa CL Brenner reveló que las mismas poseen más de un 80% de similitud. Esto hace posible no solo que las regiones empleadas para realizar las construcciones destinadas al reemplazo génico puedan ser amplificadas de cualquier cepa sino que las construcciones obtenidas muy probablemente puedan ser útiles para el intento de eliminar alelos CRT en cualquier cepa de T. cruzi. Utilizando primers específicos para el sistema MSGW amplificamos 645 y 1550 pb correspondientes a las regiones 5´ y 3´ UTR de CRT respectivamente. Estos fragmentos se clonaron en vectores donantes del Sistema MSGW. Posteriormente se recombinaron los vectores de entrada generados con un tercero conteniendo cassettes de resistencia a Neomicina e Hygromicina. De esta forma se obtuvieron las construcciones finales con las secuencias clonadas en el orden y orientación determinada: 5´UTR-Neomicina-3´UTR y 5´UTR-Hygromicina-3´UTR. Estas construcciones están disponibles para ser transfectadas en epimastigotes de T. cruzi.