Calidad ovocitaria y envejecimiento: implicancia en la biología de los gránulos corticales

WETTEN, PAULA A.; KLINSKY LAHOZ, OMAR G.; SCELTA, JULIETA; FURLÁN, MARCELO; PIZARRO, MARCELA A.; SAYEGH, FABIANA; MICHAUT, MARCELA A.

Mendoza

Congreso; Primer Congreso InterUniversitatio I+D+I Mendoza; 2021

Al momento de concebir un embarazo, la calidad ovocitaria es un factor determinante, ya que el ovocito debe tener la capacidad de sostener la fecundación y el desarrollo del embrión preimplantatorio. Existen diversas causas que pueden afectar la calidad ovocitaria a lo largo de la vida de una mujer; entre ellas, el envejecimiento. Luego de la ovulación, existe una ventana temporal óptima en la cual, los ovocitos que se encuentran en metafase II son normalmente fecundados. Pasado este período, los ovocitos no fecundados pierden su calidad óptima y experimentan un envejecimiento denominado, en este caso, envejecimiento post-ovulatorio. Por otra parte, las irregularidades durante el ciclo menstrual producidas al inicio y fines de la edad reproductiva pueden provocar un retraso en la ovulación y, en consecuencia, un deterioro progresivo en la calidad del ovocito, definido como envejecimiento pre-ovulatorio. Ya sea pre- o post-ovulatoriamente, el envejecimiento ovocitario puede ocurrir a cualquier edad en mujeres fértiles o en los tratamientos de reproducción asistida. Existe un particular interés en conocer molecularmente los mecanismos que producen el envejecimiento ovocitario, ya que a partir de ello se espera poder mejorar el rendimiento de los procedimientos de fertilidad asistida, en los cuales también pueden ocurrir ambos tipos de envejecimiento. Los gránulos corticales (GC) son vesículas secretoras de contenido enzimático que se localizan cerca de la membrana plasmática antes de la fecundación. Su papel protagónico durante la activación de los ovocitos es fundamental para el bloqueo de la poliespermia. Después de la penetración de los espermatozoides o la activación partenogenética de los ovocitos maduros, los GC se fusionan con la membrana plasmática (exocitosis) y su contenido enzimático se libera al espacio perivitelino, produciendo un cambio estructural en la zona pelúcida. Si la exocitosis de los gránulos corticales (EGC) no se produjera o fuera ineficiente, se produciría poliespermia. Por el contrario, la EGC prematura evitaría la fertilización. En cualquier caso, el resultado sería el mismo ya que no se produciría el desarrollo del embrión. Poco se sabe acerca del efecto que produce el envejecimiento en la biología de los GC. Por esto, el objetivo general de este proyecto es estudiar los efectos del envejecimiento en la biología de los gránulos corticales, con el fin de contribuir al conocimiento molecular del envejecimiento y al mejoramiento de las técnicas de reproducción asistida. Primeramente, nos enfocamos en el envejecimiento post-ovulatorio in vivo e in vitro. Para envejecer los ovocitos post-ovulatoriamente in vitro, los ovocitos en Metafase II (MII) fueron obtenidos a partir hembras estimuladas hormonalmente con PMSG (día 0) y hCG (día 2). Al cabo de 16 h post-hCG, los ovocitos fueron colectados (controles) o envejecidos in vitro por 4 h y 8 h. Para el envejecimiento post-ovulatorio in vivo, los ovocitos fueron colectados 20 h y 24 h post-hCG. Para estudiar la biología de los GC, analizamos: 1) la densidad de los GC, 2) el citoesqueleto de actina en el cual se encuentran inmersos, y 3) la expresión de alpha-SNAP, NSF y complexina, proteínas que intervienen en la fusión de membranas de los GC y la membrana plasmática durante la exocitosis de los GC. Para determinar la densidad de los GC usamos una lectina fluorescente que se une específicamente al contenido de los gránulos. La observación y cuantificación por microscopía confocal determinó que la densidad de los GC se encontró disminuida significativamente en los ovocitos envejecidos in vivo e in vitro respecto de los ovocitos controles. El citoesqueleto de actina fue evaluado mediante el uso de una sonda fluorescente que se une específicamente a la actina fibrilar (F-actina). El análisis de la intensidad de fluorescencia por microscopía confocal mostró que la organización cortical y citoplasmática de la F-actina estaba alterada en ovocitos envejecidos respecto de los ovocitos controles. Finalmente, la evaluación por inmunofluorescencia indirecta y microscopia confocal de las proteínas de fusión alpha-SNAP, NSF y complexina, mostró que la expresión de estas proteínas estaba alterada en ovocitos envejecidos respecto de los ovocitos controles. En conclusión, estos resultados sugieren que el envejecimiento post-ovulatorio in vivo e in vitro altera la biología de los gránulos corticales en detrimento de la calidad ovocitaria.