Tipificación molecular de flebótomos de un área endémica de leishmaniasis tegumentaria en la provincia de Salta, mediante PCR-RFLP del gen ARNR 18S

ALMAZÁN MC; COPA GN; LOPEZ QUIROGA I; HOYOS CL; GIL JF; MARCO JD; NASSER JR; BARROSO PA

Santa Fe

Otro; XXVIII Reunión Anual de la Sociedad Argentina de Protozoología y Enfermedades Parasitarias - SIMPOSIO Internacional de Biología Celular y Molecular de la Enfermedad de Chagas; 2016

Sociedad Argentina de Protozoología

Los vectores de la leishmaniasis son tradicionalmente identificados mediante claves dicotómicas, analizando estructuras de valor taxonómico como el cibario y la espermateca para hembras. Las principales desventajas radican en que dichas estructuras pueden ser fácilmente dañadas por mala preservación del material o durante la manipulación de los ejemplares para su montaje. Esta técnica es, además, laboriosa y demandante ya que el procesamiento de insectos implica etapas de deshidratación y clarificación. Dado que las técnicas moleculares no requieren tales procesos y tampoco se ven afectadas por daños de estructuras, tienen gran potencial para la identificación de flebótomos. El gen 18S tiene regiones conservadas que, por su alto número de copias, constituyen blancos óptimos para PCR y tipificación. El objetivo del trabajo fue estandarizar las técnicas de PCR y RFLP para la identificación de flebótomos capturados en el Departamento de Orán, Salta. Se usaron 8 trampas de luz tipo CDC desde las 7 pm hasta 8 am del día siguiente. Las hembras capturadas se colocaron en alcohol 70% para su preservación. Se les extrajo el ADN con un buffer de lisis. Mediante PCR se amplificó parte del gen 18S con los primers 5′TGCCAGTAGTTATATGCTTG 3′ y 5′CACCTACGGAAACCTTGTTAC 3′. Las restricciones se hicieron con la enzima Afa I, a 25° durante 2 horas. Inicialmente, algunas hembras fueron disectadas para ser identificadas mediante la observación de cibario y espermateca a través de la Guía de Young & Duncan, 1994. Luego de identificar 10 hembras de Nyssomyia neivai, 10 de Mygonemyia migonei y 10 de complejo sallesi-cortelezzii, se les hizo PCRRFLP para confirmar la especificidad de los patrones de bandas generados por cada ejemplar analizado. Posteriormente, 50 hembras fueron analizadas mediante PCR-RFLP. El 64% fue Ny. neivai, el 26% complejo sallesi-cortelezzii y el restante 10% fue Mg. migonei. El método propuesto resultó ser rápido y eficiente para el procesamiento de las muestras y los patrones obtenidos fueron especie?específicos. Asimismo, permite plantear la utilidad potencial, para la incriminación de vectores mediante búsqueda de infección natural con primers específicos para Leishmania. Además, este método permitiría la determinación de preferencias alimentarias de flebótomos y de esta forma focalizar las intervenciones, esfuerzos y recursos para prevenir la dispersión del parásito y,consecuentemente, mejorar la planificación de la vigilancia entomológica.