TcAdK3: Una adenilato quinasa localizada en los glicosomas de Trypanosoma cruzi

GIACOMETTI, ALINA; CAMARA, MARIA DE LOS MILAGROS; BOUVIER, LEON; PEREIRA, CA

Buenos Aires

Jornada; IX Jornadas científicas del instituto de investigaciones medicas Alfredo Lanari; 2010

Instituto de investigaciones medicas Alfredo Lanari

Introducción: Las adenilato quinasas son un grupo de enzimas responsables de mantener la homeostasis celular de ATP, catalizando la interconversión de nucleótidos de adenosina. Por esta razón, se encuentran ubicadas en regiones donde tienen lugar la síntesis y el consumo de ATP. Las células eucariotas típicas poseen tres isoformas, mientras que en tripanosomátidos se han identificado por lo menos tres isoformas adicionales. La gran diversidad de condiciones a las que se enfrentan estos parásitos durante su ciclo de vida es una posible explicación de esta diferencia. Estos organismos tienen otra particularidad ya que poseen glicosomas, organelas de la familia de los peroxisomas donde se realiza la glucólisis, proceso que habitualmente ocurre en el citoplasma. En este trabajo, presentamos el estudio de la isoforma de adenilato quinasa de localización glicosomal, la TcAdK3. Esta contiene en su extremo carboxilo terminal una señal de localización glicosomal (PTS-1, Peroxisomal Targeting Signal) que difiere del consenso.Objetivos: Dar los primeros pasos en el estudio funcional de una isoforma de adenilato quinasa en una organela tan atípica como los glicosomas.Metodología: Epimastigotes (estadio replicativo no infectivo) de Trypanosoma cruzi de la cepa CL Brener, salvajes o modificados genéticamente, se cultivan a 28°C en medio LIT (triptosa de infusión de hígado). Para la localización subcelular de TcAdK3 por inmunofluorescencia, los parásitos se fijan y permeabilizan para luego incubarlos con el anticuerpo especifico y finalmente con anticuerpo secundario asociado a fluoróforos. Como marcadores de localización se utilizarán, colorante DAPI (nuclear) y hexoquinasa (glicosomas). Para la sobre-expresión de las proteínas de interés, se construirán modelos de parásitos transgénicos a partir de epimastigotes salvajes. Los parásitos se transfectarán mediante las técnicas clásicas, utilizando plásmidos completamente diseñados en nuestro laboratorio.Resultados y Conclusiones: A partir de la información disponible sobre secuencias aminoacídicas de adenilato quinasas, se buscaron sus homólogos en T.cruzi y se clonaron seis genes correspondientes a distintas isoformas de AdK. Particularmente, el gen de la TcAdk3 se clonó, se sobre-expresó en bacterias E. coli y se purificó la proteína obtenida. Mediante análisis bioquímicos de actividad enzimática, se pudo validar la actividad de adenilato quinasa de dicha enzima. Para estudiar la localización subcelular, se diseñó un plásmido que expresaba la enzima TcAdK3 fusionada a  GFP (proteína verde fluorescente) y se transfectaron parásitos en el estadío de epimastigotes. Luego del proceso de selección, se obtuvo como resultado del análisis, una localización claramente glicosomal. Para determinar si el tripéptido C-terminal (-CKL) era el responsable de la ubicación en glicosomas, se construyeron mutantes sin el péptido, y también se fusionó el -CKL a GFP. Luego de las transfecciones, se pudo ver que los parásitos que contenían la proteína de fusión sin la señal, presentaban una distribución citoplasmática de la fluorescencia, mientras que el péptido fusionado a GFP mostraba un patrón glicosomal. Por esto, se determinó que el -CKL es una señal imprescindible para que la TcAdk3 se ubique en glicosomas. Actualmente, se continúan realizando estudios funcionales sobre esta isoforma glicosomal.