pTrypChip: Un pequeño vector modular para la manipulación genética de tripanosomas

BOUVIER, LEON; CAMARA, MARIA DE LOS MILAGROS; MIRANDA, MARIANA; PEREIRA, CA

Mar del Plata

Congreso; IX Congreso Argentino de Protozoología y Enfermedades Parasitarias (SAP); 2011

SAP

Numerosas herramientas de manipulación genética utilizadas en la actualidad son el producto del refinamiento gradual de equivalentes obtenidas originalmentemediante técnicas anticuadas. En parte al indiscutido éxito de estas moléculas, algunas de sus limitaciones también resultaron preservadas.En la mayoría de los casos el intercambio de diferentes componentes es dificultoso o requiere numerosos pasos. A su vez, generalmente fueron diseñadaspara unas pocas metodologías en organismos específicos. Por otro lado, frecuentemente los niveles de expresión obtenidos con algunas de estasherramientas, sobrepasan ampliamente los niveles fisiológicos. En este trabajo se desarrolló y construyó, a partir de constituyentes mínimos, un pequeñovector modular diseñado para la manipulación genética de tripanosomas. Existen diversas formas de intercambiar diferentes fragmentos. Estructuralmentese asemeja a pTEX (Kelly y col. 1992) sin embargo las secuencias intergénicas regulatorias se derivaron exclusivamente de Trypanosoma bruceiy fueron seleccionadas específicamente por su reducida longitud, ausencia de sitios de enzimas de restricción y por corresponder a genes constitutivos.El gen de resistencia incorporado codifica la puromicina acetilasa (PAC) y fue modificado con el objetivo de eliminar secuencias de reconocimientopara enzimas de restricción útiles en otras regiones de la construcción. A su vez expresa como una única proteína de fusión, los epítopes 3-FLAG, HA y alfa tubulina, la proteína verde fluorescente y los sitios de reconocimiento para las proteasas enteroquinasa (EK) y del virus jaspeado deltabaco (TEV). La construcción se propaga en Escherichia coli mediante un plásmido mínimo. En Trypanosoma cruzi este plásmido se comporta como un vector de expresión episomal otorgando resistencia a elevadas concentraciones de puromicina. Los niveles de expresión de la proteína de fusión, sinembargo, se encuentran claramente por debajo de los obtenidos para construcciones equivalentes basadas en pTEX. Por su parte en Trypanosoma bruceieste vector posee la potencialidad para ser utilizado como construcción de expresión ectópica y alternativamente para el reemplazo de genes porvariantes modificadas.