Estudio de la localización subcelular de la nucleósido difosfato quinasa canónica de Trypanosoma cruzi

MIRANDA, MARIANA; BOUVIER, LEON; CAMARA, MARIA DE LOS MILAGROS; PEREIRA, CA

Mar del Plata

Congreso; IX Congreso Argentino de Protozoología y Enfermedades Parasitarias (SAP); 2011

SAP

Las nucleósido difosfato quinasas (NDPKs) son enzimas que catalizan la transferencia de fosfatos de alta energía desde nucleósidos trifosfato a nucleósidosdifosfato. Si bien cumplen un rol en la homeostasis intracelular de nucleótidos, también participan en numerosos procesos celulares y por esta razón son consideradas enzimas multifuncionales. TcNDPK1 es una NDPK del parásito Trypanosoma cruzi descripta recientemente por nuestro laboratorio que reúnetodas las características de las NDPKs, tiene además actividad de nucleasa, se une a secuencias de ADN y participa en mecanismos de resistencia a drogastripanocidas. Debido a que TcNDPK1 parece ser una enzima con múltiples funciones y a que su localización, en parte, puede conducir al estudio de lafunción, en este trabajo abordamos el estudio de la localización subcelular de la TcNDPK1. Los primeros estudios realizados consistieron en la obtenciónde parásitos transgénicos que expresaban la fusión TcNDPK1-eGFP. A partir de estos parásitos observamos una señal cuyo patrón era similar al de unalocalización en la vacuola contráctil; a su vez, algunas señales eran tan grandes e intensas que permitían distinguir estructuras particuladas cuando se observababajo microscopía de contraste de fase. Sin embargo, no hubo co-localización con marcadores de dicha organela. Mediante microscopía electrónicadeterminamos que las estructuras percibidas carecían de membrana y tenían una electrodensidad diferente al de la vacuola contráctil. Las fusiones con otrasproteínas fluorescentes monoméricas y a epítopes más pequeños como el HA tuvieron una distribución citosólica completamente diferente a la previamenteencontrada. Finalmente, una vez obtenidos anticuerpos específicos contra la TcNDPK1, mediante inmunofluorescencias, logramos establecer unalocalización principalmente citosólica y perinuclear. De acuerdo con los resultados obtenidos concluimos que el fenotipo observado con la fusión a eGFPconsistió en un ?artefacto? generado tanto por la dimerización de la proteína fluorescente como por la naturaleza hexamérica de la TcNDPK1. Por otrolado, es posible sugerir una participación de la TcNDPK1 en procesos de reparación de ácidos nucleícos o regulación de la transcripción debido a la posibleconexión entre la localización perinuclear de la TcNDPK1 con su actividad nucleasa y unión a secuencias de ADN previamente descriptas.