Las nucleósido difosfato quinasas de Trypanosoma cruzi.

MIRANDA, MARIANA; BOUVIER, LEON; CANEPA, GASPAR; PEREIRA, CA

Buenos Aires

Congreso; V Jornadas científicas del instituto de investigaciones medicas Alfredo Lanari; 2006

INTRODUCCIÓN- La nucleósido difosfato quinasa (NDPK) es una enzima ubicua y altamente conservada asociada a numerosas funciones celulares e involucrada principalmente en el mantenimiento del equilibrio del “pool” de nucleótidos trifosfato en las células. Cataliza la transferencia de fosfatos desde nucleósidos trifosfato a nucleósidos difosfato, incluyendo la formación de ATP a partir de ADP. Se postula que esta enzima forma parte de una red de transferencia enzimática de fosfatos de alta energía que comunica los sitios de síntesis y de consumo de ATP dentro de la célula. En este trabajo se reporta la presencia y caracterización de dos isoformas de NDPK, TzNDPK1 y TzNDPK2 , en T. cruzi, parásito causante del Mal de Chagas. OBJETIVOS- Caracterizar bioquímicamente las dos isoformas de nucleósido difosfato quinasa presentes en el parásito Trypanosoma cruzi. Comenzar la cristalización de TzNDPK1 para determinar la estructura tridimensional por difracción de rayos x. MATERIALES Y MÉTODOS- La actividad NDPK fue medida realizando un ensayo con enzimas acopladas siguiendo la absorbancia a 340 nm. Los genes fueron amplificados por PCR y clonados en el vector de expresión pRSET A. Las proteínas recombinantes fueron producidas en E. coli BL21 y purificadas por columnas de Ni-agarosa. Las condiciones de cristalización de TzNDPK1 fueron obtenidas con el kit “Crystal Screen” (Hampton Research). RESULTADOS Y CONCLUSIONES- La actividad nucleósido difosfato quinasa fue medida en extractos de epimastigotes de T. cuzi. A partir de los datos del proyecto genoma de este parásito se determinó la presencia de dos isoformas de NDPK. Los genes fueron clonados y la actividad NDPK de ambas proteínas recombinantes denominadas TzNDPK1 y TzNDPK2 fue confirmada. Los parámetros cinéticos de TzNDPK1 fueron calculados y los primeros cristales de la enzima ya fueron obtenidos. Una localización en núcleo y posible localización en flagelo fue descripta para las proteínas ortólogas de TzNDPK1 y TzNDPK2 en T. brucei respectivamente. La caracterización de estas fosfotransferasas nos permitirá introducirnos en el estudio de redes enzimáticas de fosfotransferencia a nivel nuclear y flagelar en T. cruzi.