Desarrollo de un Protocolo para Determinar Niveles de ARN del Gen Ebaf en el Oviducto de Rata Mediante RT-PCR Cuantitativa Competitiva

SEBASTIAN FEROLI; MARTIN E. ARGAÑARAZ; PABLO A. VALDECANTOS; DORA C. MICELI

San Miguel de Tucumán, Tucumán

Jornada; IVº Jornadas Científicas y Encuentro de Jóvenes Investigadores Augusto Palavecino; 2003

En los mamíferos el desarrollo embrionario se inicia en el oviducto; durante esta etapa el embrión recibe del microambiente oviducal factores necesarios para su desarrollo normal. Distintas proteínas han sido identificadas en el oviducto de mamíferos; sin embargo, la función de estas macromoléculas en los procesos de fecundación y desarrollo embrionario todavía es desconocida. En nuestro laboratorio se ha clonado previamente un fragmento de ADNc (denominado Pr14), cuya expresión está restringida al oviducto durante la fase luteal tardía y en la preñez temprana y al útero. Este fragmento de ADNc presenta una identidad del 100% con una secuencia de ADN de rata (No. de acceso NW_047400) que se ubica corriente abajo del exón terminal de un gen (Locus Link No. de acceso LOC289316) similar a la protelna ebaf (endometrial bleeding- associated factor) perteneciente a la superfamilia del Factor de Crecimiento Transformante (TGF-B). Debido a la potencial importancia de la protelna codificada por esto gen en el oviducto ya que podría tener una función diferente a la conocida hasta el momento ya que solo fue descripta en útero de humanos con funciones durante el proceso de menstruación, nos propusimos estudiar la expresión del mismo mediante la reacción en cadena de la polimerasa acoplada a la transcripción reversa (RT-PCR) cuantitativa competitiva. Para ello se obtuvieron muestras de ARN total de oviduclos de ratas normales en distintos estadios del ciclo sexual. Para poder cuantificar los niveles de un ARN mensajero en particular, esta técnica utiliza competidores internos que contienen las secuencias de los cebadores especlficos que se agregan en un n° conocido de copias a cada reacción de amplificación. Hemos obtenido amplicones para el gen ebaf de rata conteniendo la secuencia Pr14 y para la actina; a partir de ellos se obtendrán competidores para la RT-PCR cuantitativa competitiva. Ambos , fragmentos fueron clonados en el vector pBluescript digerido con la enzima de restricción Hae III y al cual se le añadieron previamente desoxitimidinas en los extremos 3'.