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DESARROLLO DE UN BIOSENSOR ROTATORIO PARA LA DETERMINACIÓN DE ÁCIDO PIPEMÍDICO EN FLUIDOS BIOLÓGICOS Franco A. Bertolino, Valeria Rivero *, Noelia A. Martínez, Eloy Salinas, Ángel A. J. Torriero, Julio Raba. a Departamento de Química, Facultad de Química, Bioquímica y Farmacia, Universidad Nacional de San Luis, Chacabuco y Pedernera 5700, San Luis, Argentina. E-mail: torriero@unsl.edu.ar Introducción El ácido pipemídico (AP) (acido 8-etil-5,8-dihidro-5-oxo-2-(1-piperazinil) pirido[2,3-d]pirimidina-6-carboxilico) es un agente antibacteriano sintético pertene-ciente a la familia de las quinolonas. Las propiedades antibacterianas de las quinolonas están asociadas a su potencial para inhibir la enzima topoisomerasa II (DNA girasa) bacteriana. Su efectividad depende de la estructura de la quinolona[1]. El ácido pipemídico es ampliamente utilizado en el tratamiento de infecciones del tracto urinario, mostrando alta actividad contra bacterias gram-positivas y gram-negativas. Metodología El principio de medida de este biosensor para la determinación AP se muestra en el esquema 1. Primero, la tirosinasa inmovilizada sobre un disco rotatorio convierte catecol (Q) en o-quinona (P), la cual es nuevamente reducida a Q en la superficie del electrodo (a -200 mV vs. Ag/AgCl/NaCl 3M). Segundo, la detección de AP es realizada suprimiendo el proceso cíclico entre tirosinasa y electrodo (señalado en esquema 1 con líneas de trazo). Por tanto, el principio de detección es similar al usado en biosensores con diferentes sustratos que compiten por el mismo sitio activo[2]. Los resultados obtenidos con el método propuesto fueron comparados con los obtenidos por HPLC. Resultados Para la medida de AP, se usó el siguiente procedimiento: (a) se estableció una línea base con la solución buffer; (b) se inyectó en el biosensor una solución conteniendo 1 mM Q; (c) el flujo fue detenido y el disco rotado a 900 rpm, de esta manera, se obtuvo una corriente de reducción debido al derivado quinónico; después de 1 minuto el flujo fue reestablecido; luego (d) fue inyectada una solución conteniendo 1 mM Q y distintas concentraciones de AP, (e) el flujo fue detenido y el disco rotado a 900 rpm y la corriente resultante fue medida. Luego de 1 minuto, el flujo fue reestablecido. Una relación linear, ΔI (μA) = 7.5 x 10-3 + 0.51[CPA], se obtuvo graficando ΔI vs. concentración de AP en el rango comprendido entre 0.02 y 70 mM (Figura 1). A pesar de esto, el rango biológicamente útil se encuentra comprendido entre 0.02 y 10 mM. El coeficiente de correlación para esta gráfica fue de 0.999. El límite de detección (DL) fue calculado como la cantidad de AP requerida para dar un pico neto igual a tres veces la desviación estándar de la señal pura de Q. En este estudio, la mínima diferencia de concentración de AP fue de 9 nM. Ensayos de reproducibilidad fueron realizados usando soluciones estándares (n = 5) conteniendo 1.0 mM Q y 10 mM AP; el porcentaje de error estándar fue menor del 3%. Figura 1. Influencia de pH sobre la magnitud de la señal de 1.00 mM Q, en la presencia de distintas concentraciones de AP, usando buffer fosfato (■) pH 4, (●) pH 5, (▲) pH 6 y (♦) pH 7. Se estudiaron los efectos de varios compuestos capaces de producir interferencia en la medida amperométrica de P. La adición de 10 mM de ácido ascórbico resultó en la disminución de la señal en aproximadamente un 4 % comparado con la corriente de reducción obtenida con 1 mM Q. Los datos muestran que la reacción entre las quinonas y los grupos amino secundarios libres son mucho más rápidos que la reacción con el ácido ascórbico[3]. A pesar de este hecho y debido a que la concentración en suero de ácido ascórbico y analito de interés son del mismo orden, es que pensamos que esta interferencia puede ser de gran importancia para la determinación de AP. Por otro lado, la mayoría de los grupos sulfhídricos libres residen en compuestos tales como glutatión (GSH), cisterna (Cys) y homocisteína[4] (forma reducida). La concentración de Cys en suero es menor (rango mM) que la concentración de GSH (1-3 mM). Ambos compuestos pueden reaccionar con Q a través de su grupo SH libre. Por tanto, la concentración de GSH es más crítica como interferente. Las formas oxidadas de Cys y GSH, así como las de otros compuestos que poseen grupos que contienen azufre tal como metionina, lisina y ácido úrico mostraron poco o ningún efecto sobre la respuesta del biosensor. Para eliminar los efectos interferentes de todos estos compuestos, se realizó la cuantificación de AP haciendo uso del método de adición estándar. Para chequear este hecho, se adicionaron diferentes concentraciones conocidas de AP a una muestra sintética conteniendo conocida concentración de AP, ácido ascórbico, Cys y GSH (en concentración proporcional a la encontrada en suero) antes de la inyección y de la medida. De esta manera, se obtuvo una recuperación del 100.2 %, eliminando toda posible interferencia. Por otro lado, se estudió la posible interferencia generada por la presencia de agentes oxidantes en la muestra. Para lo cual, se inyectó en el biosensor rotatorio sin enzima inmovilizada en la superficie del disco una muestra de plasma conteniendo 1 mM de Q; el flujo fue detenido manteniendo la rotación del disco a 900 rpm, de esta ensayo se observó ausencia de corriente derivada de la oxidación de Q; después de 1 minuto, el flujo fue reestablecido. Por tanto, interferentes con capacidad de actuar como oxidantes no han sido encontrados en esta matriz. La elevada sensibilidad obtenida con el uso del método propuesto permite la determinación de AP en fluidos biológicos. Por tanto, el método propuesto fue aplicado a la determinación de AP en muestras de plasma humano dopadas con dicho fármaco. Conclusiones En el presente trabajo se demuestra la utilidad del biosensor rotatorio desarrollado para la determinación de bajas concentraciones de AP. Este biosensor es el primero desarrollado para la determinación de este principio activo. Esta forma de detección (adición sobre sustrato) resulta interesante y prometedora para la determinación de analitos de interés en muestras de interés biológico y farmacológico. Además, este biosensor posee la particularidad de operar como una unidad de detección rápida, económica y sensitiva cuando es incorporada en un sistema FIA. Referencias [1] J.F. Barrett, J.I. Bernstein, H.M. Krause, J.J. Hilliard, K.A. Ohemeng, Anal. Biochem. 214 (1993) 313. [2] F. Scheller, F. Achubert. Biosensors-Techniques and Instrumentation in Analytical Chemistry. Elsevier, Amsterdam, 1991. [3] J.J.J. Ruiz-Díaz, A.A.J. Torriero, E. Salinas, E.J. Marchevsky, M.I. Sanz, J. Raba, Talanta 68 (2006) 1343. [4] P.C. Joselyn, Biochemistry of the SH group. Academic Press, New York, 1972.

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