Oxidación enzimática de 4-tert-butilcatecol en presencia de compuestos con grupos sulfhídricos: aplicación a la detección amperométrica de penicilamina

ANGEL A. J. TORRIERO; NOELIA A. MARTÍNEZ; FRANCO A. BERTOLINO; ELOY SALINAS; JULIO RABA; JUANA J. SILBER

San Luis, Argentina

Congreso; XXVI Congreso Argentino de Química; 2006

Asociación Argentina de Química

OXIDACIÓN ENZIMÁTICA DE 4-TERT-BUTILCATECOL EN PRESENCIA DE COMPUESTOS CON GRUPOS SULFHÍDRICOS: APLICACIÓN A LA DETECCIÓN AMPEROMÉTRICA DE PENICILAMINA     Angel A. J. Torriero a, Noelia A. Martínez a*, Franco A. Bertolino a, Eloy Salinas a, Julio Raba a, Juana J. Silber b   a Departamento de Química, Facultad de Química, Bioquímica y Farmacia, Universidad Nacional de San Luis, Chacabuco y Pedernera 5700, San Luis, Argentina. E-mail: torriero@unsl.edu.ar b Departamento de Química , Universidad Nacional de Río Cuarto Agencia postal N0 3, 5800 Río Cuarto, Córdoba, Argentina.     Introducción Penicilamina (acido 2-amino-3-mercapto-3-metilbutanoico) (PA) es un compuesto derivado de la degradación hidrolítica de penicilina[1], la cual carece de actividad antibiótica. Es posible encontrarla en sus dos formas enantioméricas (D y L), las cuales muestran diferentes propiedades biológicas y toxicológicas. D-PA es el agente terapéutico con mayor potencia usado por muchos años en el tratamiento de varias enfermedades. Es la droga de primera elección para pacientes con enfermedad de Wilson[2] , un desorden autosomal recesivo del transporte de cobre[3]. Es además utilizado como un agente quelante oral en el tratamiento de intoxicación con metales pesados tales como plomo, arsénico y mercurio. También es utilizado como un agente antifibrótico en tratamiento de escleroderma y como una droga antirreumática para tratar pacientes con artritis reumatoidea activa. Por otra parte, PA reduce el exceso de la excresión de cistina en la Cistinuria, enfermedad no hereditaria que afecta el transporte activo de aminoácidos cistina, ornitina, lisina y arginina a través de los tubulos renales y del intestino delgado[4].   Metodología En el presente trabajo, se realizó la determinación de penicilamina utilizando un biosensor enzimático rotatorio mediado por 4-t-butilcatecol (4-TBC). La peroxidasa de rabanito (HRP, 1.11.1.7) inmovilizada sobre un disco rotatorio, en presencia de peróxido de hidrógeno, cataliza la oxidación de 4-t-butilcatecol. Estos productos son electro-químicamente reducidos sobre la superficie de un electrodo de carbono vítreo aplicando un potencial de - 150 mV (Esquema 1). Cuando se adiciona PA a la solución, este reacciona con 4-t-butilcatecol (adición tipo Michael) oxidado enzimáticamente para formar el derivado quinónico correspon-diente y así disminuir el pico de corriente generado, proporcionalmente al incremento de la concentración de PA adicionado.    Electrooxidación de 4-tert-butilcatechol en la ausencia y presencia de PA La voltametría cíclica de una solución 1 mM de 4-tert-butilcatecol (4-TBC) en una solución acuosa conteniendo buffer fosfato 0.10 M (pH 7.0) como electrolito soporte, muestra un pico anódico (A1) y su correspondiente pico catódico (C1), los cuales corresponden a la transformación de 4-TBC en o-benzoquinona y vice-versa en un proceso cuasi-reversible de 2 electrones (Fig. 1, curve a). Una relación de corriente de pico () de prácticamente igual a la unidad, particularmente durante repetidos ciclos de potencial, puede ser considerado como un criterio para la estabilidad de la o-quinona producida en la superficie del electrodo bajo las condiciones experimentales usadas. En otras palabras, cualquier reacción de hidroxilación ó dimerización son demasiado lentas para ser observadas en la escala de tiempo de la voltametría cíclica. También, se estudió la oxidación de 4-TBC en la presencia de PA como nucleófilo. La figura 1, curva b, muestra el voltamograma cíclico obtenido para una solución de 1 mM de 4-TBC en la presencia de 2.5 mM de PA. El voltamograma exhibe un pico anódico a 310 mV versus Ag/AgCl/3M NaCl, mientras que la contraparte catódica de dicho pico (C1) ha desaparecido.   Se evaluó la influencia de concentraciones crecientes de PA sobre el desarrollo electroquímico de 4-TBC, la respuesta obtenida se muestra en la Figura 2. La altura del pico de oxidación se incrementa con el aumento de la concentración de PA; con la pérdida del correspondiente pico de reducción, lo cual es consistente con un mecanismo del tipo ECE (propuesto en el Esquema 1). La sucesiva disminución en la altura del pico de reducción de 4-TBC se debe a la formación del aducto 4-TBC-PA, reduciendo la concentración de la forma oxidada de 4-TBC de tal manera que cuando se invierte el sentido del barrido del voltamograma, hay poco producto disponible para su electro-reducción. Una evaluación cuantitativa del cambio de corriente del pico (ΔI) de 4-TBC en función del pH, cuando se le adiciona PA en concentraciones crecientes,  demuestra que la respuesta decrece con el aumento de la acidez de la solución. Este hecho se atribuye a que el aumento de la acidez permite que el grupo tiol se protone (PA, pKa ~8.4) y así las características nucleofílicas del grupo tiol se disminuyan. De esta manera, se seleccionó buffer fosfato 0.1 M de pH 7.00 para este trabajo en concordancia con el valor de pH más estable de la enzima.   Efecto del volumen de la celda y del tamaño de la muestra. El volumen de la celda se modificó desde 150 µl a 1 mL removiendo el O-ring entre la tapa y la base del reactor. La velocidad de la respuesta, como es esperada, disminuye linealmente con el incremento del volumen de la celda, debido al efecto de dilución, el cual es favorecido por la rotación. Para el estudio fue aplicado un volumen de celda de 150 µl. Figura 1. Voltametría Cíclica de 1 mM de 4-TBC en buffer fosfato 0.1 M (pH 7.00): (a) en la ausencia; (b) en la presencia de 2.5 mM PA; y (c) 1 mM PA en la ausencia de 4-TBC, usando un electrodo de carbono vítreo (3 mm diámetro). Velocidad de Barrido: 100 mV s-1; T: 25 ± 1 ºC.   Figura 5. Voltagrama de 0.5 mM 4-TBC en buffer fosfato 0.1 M (pH 7.00) usando carbono vítreo (3 mm de diámetro)  como electrodo de trabajo conteniendo varias concentraciones de PA; CPA: a) 0.0; b) 0.09; c) 0.17; d) 0.29; e) 0.37; f) 0.67 mM; Velocidad de barrido: 100 mV s-1, T: 25 ± 1 ºC.     Determinación de Penicilamina Para la medida de PA, se usó el siguiente procedimiento: (a) se estableció una línea base con la solución buffer; (b) se inyectó en el biosensor una solución conteniendo 1 mM 4-TBC y 0.1 mM H2O2; (c) el flujo fue detenido y el disco rotado a 900 rpm, de esta manera, se obtuvo una corriente de reducción debido al derivado quinónico; después de 1 minuto el flujo fue reestablecido; luego (d) fue inyectada una solución conteniendo 1 mM 4-TBC, 0.1 mM H2O2, y distintas concentraciones de PA; (e) el flujo fue detenido y el disco rotado a 900 rpm y la corriente resultante fue medida.  Luego de 1 minuto, el flujo fue reestablecido. Una curva de calibrado para PA se obtuvo graficando ΔI vs. concentración de PA. De esta grafica se obtuvo una relación linear en el rango 0.02 y 80 mM, cuya ecuación fue ΔI (μA) = 8.7 x 10-3 + 0.543 [CPA]. El límite de detección (DL) fue calculado como la cantidad de PA requerida para dar un pico neto igual a tres veces la desviación estándar de la señal pura de 4-TBC. En este estudio, la mínima diferencia de concentración de PA fue de 0.7 nM. Ensayos de reproducibilidad fueron realizados usando soluciones estándares (n = 5) conteniendo 1.0 mM 4-TBC, 0.1 mM H2O2 y 10 mM PA; el porcentaje de error estándar fue menor del 3%. Para comprobar la estabilidad del biosensor se inyectó cada cuatro muestras una solución conteniendo 1.0 mM 4-TBC, 0.1 mM H2O2 y 10 mM PA; observando una disminución de la señal igual al 5% luego del paso de 8 muestras. Los excipientes frecuentemente adicionados a las formulaciones farmacéuticas de PA son povidona, Talco, lactosa, estearato de magnesio, hidroximetilpropil celulosa, oxido de titanio, y polietilen glicol. La respuesta de PA con excipientes usando una formulación artificial fue comparada con la respuesta de PA en una solución estándar. Como resultado se encontró la misma señal en ambos casos. Por tanto, excipientes comúnmente encontrados en típicas preparaciones farmacéuticas no interfieren con la cuantificación de PA presente como principio activo. Este método, desarrollado para la determinación de PA fue aplicado a dos diferentes preparaciones comerciales.   Conclusiones El biosensor desarrollado en este trabajo demostró ser más sensitivo que otros desarrollados en previos trabajos. Este tipo de detección (reacción de adición sobre co-substratos) resulta interesante para ser aplicado en muestras farmacológicas; este biosensor es capaz de operar como una unidad sensitiva, selectiva y rápida cuando es incorporada a un sistema FIA, además de generar una solución rápida, efectiva y de bajo costo para la cuantitativa determinación de bajas concentraciones de PA.   Referencias [1] J.M. Walshe, Mov. Disord. 18 (2003) 853. [2] J.M. Walshe, Am. J. Med. 21 (1956) 487. [3] B. Sarkar, Chem. Rev. 99 (1999) 2535. [4] A.D. Stephens, J. Inherit. Metab. Dis. 12 (1989) 197.