Drosophila melanogaster como modelo de enfermedades cardiovasculares humanas. Rol de CaMKII y eIF4E-1/2 en cinética del calcio intracelular y la generación de arritmias

SANTALLA M; VALVERDE CA; LACUNZA E; MATTIAZZI A; FERRERO P

La Plata

Jornada; Jornadas de Medicina; 2014

Facultad de C. Médicas - UNLP

Introducción: Nuestro grupo de trabajo emplea a Drosophila melanogaster como modelo de estudio de enfermedades cardiovasculares humanas. La elección de este modelo reside en la alta homología entre sus genes y los de humanos y, la amplia capacidad para tolerar modificaciones genéticas de este organismo, hechos que lo convierten en un organismo competente para el estudio de la fisiología cardiovascular a través de modificaciones en diversos genes de interés.  Analizamos la fisiopatología de D melanogaster en distintas líneas transgénicas, haciendo principal énfasis en la generación de arritmias y el manejo del calcio intracelular (Ca+2i), componente fundamental del acoplamiento éxcito-contráctil (AEC). Contamos con una línea portadora de un sistema reportero1 que detecta los cambios en los niveles de Ca+2i, a quien llamaremos ?línea control? ya que no posee otra alteración genética. Estudiamos el rol arritmogénico de dos proteínas, la quinasa dependiente de calcio y calmodulina (CaMKII) y el factor eucariota de inicio de la traducción (eIF4E-1/2) a edades tempranas (7 días). Para ello, utilizamos líneas transgénicas que sobreexpresan CaMKII y eIF4E-1/2. Los individuos de estas líneas fueron cruzados con los de la línea control. La F1 resultante, portadora tanto del sistema reportero como de los transgenes propios de cada línea, fue utilizada para los estudios fisiológicos y moleculares.   Objetivos: Analizar el efecto de los cambios en los niveles de expresión de CaMKII y eIF4E-1/2 sobre el transitorio de Ca+2i y el índice de arritmias en D melanogaster.   Materiales y métodos: Las cepas se desarrollaron en viales rellenados con una mezcla de harina de maíz, agar, glucosa y levadura, suplementado con 1% de antimicótico. Para realizar los estudios funcionales, los preparados semi-intactos de corazones se llevaron a cabo según lo descripto2 y se observaron en un microscopio confocal Carl Zeiss 410 para medir los cambios en la fluorescencia emitida por la proteína sensible al Ca2+i. Con los registros obtenidos se procedió a medir los siguientes parámetros fisiológicos: amplitud de los transitorios, tiempo al pico (TTP), tiempo a la mitad de la relajación (t ½), duración del transitorio a la mitad del máximo (HDHM), máxima velocidad de subida y bajada del transitorio (+dF/dt y ?dF/dt, respectivamente) y la variabilidad de la frecuencia, como índice de arritmias (IA)3. Mediante inmunoblots se comprobaron los niveles diferenciales de proteínas.   Resultados: La sobreexpresión de eIF4E-1/2 provocó una disminución en la velocidad de subida (0,29 vs 0,54 unidades de fluorescencia/seg (UF/seg)), y la  amplitud del transitorio de Ca+2i respecto a la línea control (0,72 vs 1,64 UF) y en el t ½ (0,14 vs 0,18 seg). El índice de arritmias aumentó de 0,2 seg en la línea control a 0,33 seg en la línea  que sobreexpresa eIF4E-1/2. La sobreexpresión de CaMKII aumentó la amplitud del transitorio de Ca+2i  (6 vs 2,5 UF), la derivada positiva (+dF/dt) de 0,75 a 1,1 UF/seg, y redujo el tiempo al pico del transitorio (0,2 vs 0,14 seg). El IA disminuyó respecto a la línea control (0,15 vs 0,2 seg).   Conclusiones: - La sobreexpresión de eIF4E-1/2 reduce la contractilidad (amplitud  y + dF/dt) y acelera la relajación (t ½); así mismo, aumenta el IA. - La sobreexpresión de la CaMKII aumenta la contractilidad (amplitud  y + dF/dt) y  disminuye  el tiempo al pico, con respecto a la línea control. A su vez, se observó una disminución en el IA. Estos resultados indican la participación de CaMKII en el AEC en D melanogaster. Aunque CaMKII se ha asociado en mamíferos con la producción de arritmias cardíacas, no encontramos evidencias de este efecto en D melanogaster. Por otra parte, describimos por primera vez la participación de eIF4E-1/2  en el AEC del corazón de  D melanogaster y su posible participación en la producción de arritmias cardíacas.