ESTUDIO DEL POSIBLE PAPEL DE LA VÍA ENDOCÍTICA EN LA INTERNALIZACIÓN DEL VIRUS DE LA BURSITIS INFECCIOSA AVIAR (IBDV)

V.DI FRANCESCO; M.F. QUEVEDO; M.C. GIMÉNEZ; M.I. COLOMBO; L.R. DELGUI

Mendoza

Jornada; III Jornadas de Investigación UMaza; 2011

Area Ciencia y Técnica de UMaza

La endocitosis es un proceso celular mediante el cual porciones de la membrana plasmática junto a material extracelular son internalizados en la célula. Esta vía constituye el mecanismo mayormente utilizado por los agentes virales para su ingreso a las células. Luego de ser endocitados, diversos virus requieren ser transportados hacia compartimentos acídicos para completar su penetración y replicación dentro de la célula. IBDV es un importante patógeno aviar perteneciente a la familia Birnaviridae cuyo genoma está compuesto por dsRNA. Hemos iniciado el estudio del posible papel de la vía endocítica en el ciclo de replicación del IBDV, dado que varios antecedentes sugieren que IBDV podría requerir la maquinaria de la endocitosis en su ciclo de replicación. En primer lugar hemos analizado el papel de las proteínas de endosomas tempranos Rab5 y de endosomas tardíos Rab7 en la infección por el virus. Para ello, se sobre-expresaron las mencionadas proteínas fusionadas a la proteína fluorescente verde (EGFP) en células HeLa. Estudios previos han demostrado que la sobre-expresión de Rab5 produce un aumento en la tasa de endocitosis en las células transfectadas, por lo tanto analizamos su efecto en la infección por el virus. Como control se utilizó la sobre-expresión de la proteína EGFP solamente. Las células fueron infectadas con una suspensión conteniendo 1 PFU/célula de una preparación de viriones y los cultivos fueron incubados durante 36 hs a 37ºC. El porcentaje de células infectadas fue analizado mediante microscopía confocal. Se ha podido observar un aumento significativo en el número de células infectadas en aquellas que sobre-expresan la proteína EGFP-Rab5wt y -Rab7wt en relación a las que sobre-expresan sólo la proteína EGFP, observación que constituye un indicio de la utilización de la vía endocítica por parte del virus. En una segunda etapa hemos analizado si la acidificación de los endosomas es un requerimiento para la entrada de IBDV a las células hospedadoras. Para ello utilizamos inhibidores de la acidificación endosomal como el cloruro de amonio (NH4Cl) y Bafilomicina A. El NH4Cl es una base débil que neutraliza el pH de las vesículas ácidas intracelulares mientras que la Bafilomicina A es un inhibidor específico de la bomba ATPásica de H+ vacuolar. Cultivos de células HeLa fueron tratadas con los mencionados inhibidores e infectadas con IBDV. Se determinó mediante microscopía confocal el porcentaje de células infectadas en células tratadas en relación a las células sin tratar. Se ha podido observar que ambos inhibidores de la acidificación intravesicular causaron una marcada reducción del porcentaje de células infectadas con el virus. Los resultados preliminares obtenidos constituyen sólidos indicios acerca de la participación de la vía endocítica en la internalización de IBDV en las células hospedadoras. Además, estos resultados forman parte del primer estudio de la vía involucrada en el ingreso de estas partículas virales a las células.