Influencia de la arquitectura tumoral sobre la respuesta al tratamiento fotodinámico de células de cáncer de colon?

MARIA JULIA LAMBERTI; MARÍA FLORENCIA PANSA; NATALIA B RUMIE VITTAR; VIVIANA A RIVAROLA

Cordoba

Jornada; Segunda Reunión de Fotobiólogos Moleculares Argentinos Segunda Reunión de Fotobiólogos Moleculares; 2013

Grupo Argentino de Fotobiología

La Terapia Fotodinámica (TFD) es una modalidad terapéutica contra el cáncer que involucra la destrucción de células inducida por la luz, las cuales han sido previamente sensibilizadas por la administración de un agente fotosensibilizador (FS). Se ha reportado que la arquitectura tumoral afecta las características fisio-patológicas y consecuentemente la respuesta a terapias anti-neoplásicas. La simulación de las condiciones tridimensionales (3D), contrario a los cultivos bidimensionales (2D), asegura la reproducción de interacciones célula-célula y célula-matriz existentes en los tejidos reales aumentando el poder predictivo de los modelos de cultivos que imitan las características del microambiente a estudiar. El objetivo de este trabajo fue comparar el efecto de la TFD sobre células de cáncer de colon SW480 en modelos de cultivo 2D y 3D. Se utilizó como prodroga un derivado metilado del ácido 5-aminolevulínico (ALA-Met), precursor del FS endógeno protoporfirina IX (PpIX). En primer lugar, se generaron estructuras 3D que imitan la arquitectura tumoral, aquí denominadas ?esferoides?, a partir de dos técnicas diferentes: líquido sobrelapante (liquid overlay, LO) y gota colgante (hanging drop, HD). El crecimiento de esferoides formados a partir de 1000, 5000, 10000 y 20000 células iniciales fue supervisado por la medición del radio luego de 3 días de incubación. Con la técnica HD, los cultivos 3D presentaron un radio de 155.07±15.47 um, 283.17±17.93 um, 350.98±11.41 um y 465.05±20.58 um, y con la técnica LO, 212.64±17.42 um, 354.33±23.56 um, 340.00±15.95 um y 476.06±20.43 um, respectivamente. Para los ensayos posteriores, se seleccionaron los esferoides originados a partir de 20000 células debido a que por su tamaño representan los gradientes de oxígeno y demás nutrientes de tumores en desarrollo, utilizando la técnica LO. El desarrollo de cultivos 3D con la técnica LO resultó más eficiente en términos de rendimiento, integridad y morfología regular en comparación con HD, a pesar de no observarse diferencias estadísticamente significativas en el tamaño de los esferoides seleccionados.  La viabilidad celular en respuesta a la TFD se evaluó con el ensayo MTT sobre células SW480 crecidas como monocapa y esferoides. Inicialmente, se utilizó el protocolo convencional en el cual la prodroga ALA-Met (0.3 mM) se incubó 4 h para permitir la formación de PpIX, y posteriormente los cultivos fueron irradiados con dosis crecientes de luz (0.1 J/cm2 ? 1.5 J/cm2, MultiLED, Intensidad: 0.89 mw/cm). Bajo estas condiciones, la dosis letal 50 (DL50) fue de 0.301±0.002 J/cm2 para cultivos 2D, y 0.883±0.005 J/cm2 para cultivos 3D. La distribución espacial que adoptan las células tumorales creciendo como esferoides podría retrasar la incorporación de la prodroga y consecuentemente la formación del FS, lo que explicaría en parte la resistencia observada a la TFD. Por lo tanto, a continuación se evaluó la cinética de formación de PpIX en cultivos 3D de SW480. Los esferoides se incubaron durante 4, 12 y 24 h con ALA-Met y se observó la fluorescencia de PpIX por microscopía confocal (exc: 514 nm; em585 nm). La producción del FS aumentó 1.8 veces con respecto al control (células sin droga) cuando los esferoides fueron incubados con ALA-Met durante 24 h (p<0.001), mientras que con 4 y 12 h de incubación, no se observaron diferencias estadísticamente significativas. Teniendo en cuenta estas observaciones, se modificó el protocolo de TFD incubando los esferoides con ALA-Met durante 24 h previo a la irradiación. De esta forma, la DL50 descendió a 0.326±0.005 J/cm2. Con estos resultados, se concluye que la arquitectura tumoral influye en la sensibilidad de las células tumorales al tratamiento fotodinámico. La incorporación del FS resultó ser un factor clave en el fenotipo resistente observado, por lo que debe ser tenido en cuenta al momento de diseñar un protocolo terapéutico antitumoral.  Sibata CH, et al. Braz J Med Biol Res. 33(8), 869, 2000.  Witz IP. Cancer Microenviron., 2(1):9, 2009.  Kosharskyy B, et al. Cancer Res. 66(22), 10953, 2006.  Mazzoleni G, et al. Genes Nutr. 4(1), 13, 2009.  Kennedy J. et al.  J Photochem Photobiol B., 14(4), 275, 1992.  Hirschhaeuser F, et al. Journal of Biotechnology, 148, 3, 2010.