Posibles modelos angiogénicos in vitro e in vivo para estudiar pacientes con alta y baja respuesta a gonadotropinas

SCOTTI LEOPOLDINA; ABRAMOVICH DALHIA; PASCUALI NATALIA; HARO DURAND LUIS; BISIOLI CLAUDIO; DE ZUÑIGA IGNACIO; TESONE MARTA; PARBORELL FERNANDA

Congreso; XV Congreso Argentino de Medicina Reproductiva (SAMER); 2012

SAMER

En la última década, las técnicas en reproducción asistida (ART) han mostrado un desarrollo significativo. A pesar de ello, las pacientes con alta y baja respuesta a gonadotrofinas permanecen siendo un gran problema para los especialistas en fertilidad. Las pacientes altas respondedoras (AR) se caracterizan por tener más de 15 ovocitos recuperados. En cambio, las pacientes bajas respondedoras (BR) se caracterizan por presentar una baja reserva ovárica. Las gonadotrofinas, los esteroides y las sustancias vasoactivas son reguladores claves en la regulación de la vasculatura ovárica. El sistema de ANGPTs actúa junto al sistema de VEGF en el desarrollo de una red vascular estable y funcional. Previamente, hemos observado que los niveles de ANGPT1 en el fluido folicular (FF) se encontraban aumentados en las pacientes AR y BR comparado a pacientes controles (C). No se observaban diferencias en cuanto a los niveles del receptor soluble de ANGPT1, Tie-2 en ambos grupos de pacientes. Además, FF de pacientes AR incubados con un inhibidor de ANGPT1 disminuían la migración de células endoteliales. Los objetivos fueron: “Pacientes AR”, * Evaluar el efecto de FF incubados en presencia de un inhibidor de ANGPT1 sobre la expresión de proteínas claves de uniones intercelulares en una línea endotelial y en un modelo de angiogénesis in vivo; y en “Pacientes BR”, * Evaluar el efecto de FF sobre la migración celular y sobre la expresión de proteínas claves de uniones intercelulares en una línea endotelial y en un modelo de angiogénesis in vivo. Este estudio fue desarrollado con 39 pacientes entre 25 y 41 años de edad sometidas ART con el consentimiento informado antes de la recuperación ovocitaria. Este estudio fue aprobado por el comité de ética del Instituto de Biología y Medicina Experimental (IBYME-CONICET, Buenos Aires, Argentina). Pacientes con patologías como endometriosis, fibrosis uterina, quistes ováricos o inflamación pélvica fueron excluidas del estudio. Las pacientes fueron clasificadas en tres grupos respecto al número de ovocitos recuperados: controles (C; n=15; 8-13 ovocitos), BR (n=17; 0-5 ovocitos) y AR (n=19; 15-25 ovocitos). Los FF se centrifugaron (10 min a 2000xg) para remover restos celulares. Se guardó el sobrenadante a –80º C antes de los ensayos. Se analizó el efecto de los FFh incubados con un anticuerpo neutralizante ANGPT1 sobre la migración celular (ensayo por herida), la expresión de claudina-5, b-catenina y ZO-1 (western blot) en una línea endotelial EA.hy926. Además, se evaluó el efecto de estos FF sobre un modelo de angiogénesis in vivo (membrana corioalantoidea de embrión de codorniz, CAM). Los datos se indican como la media ± ES (p<0,05). Las comparaciones estadísticas entre los grupos se realizaron utilizando el análisis de varianza (ANOVA). Los resultados mostraron que en la línea endotelial los FF de pacientes AR disminuían la expresión de la proteína claudina-5 pero en presencia del inhibidor de ANGPT1 se revertía este efecto comparado a FF de C (p<0,05). No se encontraron diferencias significativas en la expresión de la forma fosforilada de b-catenina ni de ZO-1.  Los FF de pacientes BR aumentaron la migración celular respecto a los C (p<0,001) pero no se observaron cambios en los niveles de claudina-5 y ni de  b-catenina. Por otro lado, en el ensayo de CAM, los FF de pacientes AR como de BR causan un aumento significativo en las ramificaciones y en el calibre vascular comparado al C (p<0,001). La inhibición de ANGPT1 lo revirtió. Estos resultados se correlacionan con la expresión de la integrina αvβ3 (parámetro angiogénico) en CAM. En conclusión, los resultados sugieren que niveles adecuados de ANGPT1 son necesarios para obtener una respuesta ovárica normal unida a una vasculatura funcional. La falla en los mecanismos que regulan una angiogénesis normal podría ser responsable en parte del tipo de respuesta del ovario frente a las gonadotrofinas.