La unión de vanadato a la Na,K-ATPasa estabiliza la forma E2 sin que la oclusión de K+ sea necesaria

JOSÉ L. E. MONTI, ROLANDO C. ROSSI Y MÓNICA MONTES

Buenos Aires

Congreso; XL Reunión Sociedad Argentina de Biofísica; 2011

Sociedad Argentina de Biofisica

La unión de vanadato a la Na,K-ATPasa estabiliza la forma E2 sin que la oclusión de K+ sea necesaria RESERVADO SAB José L. E. Monti, Rolando C. Rossi y Mónica R. Montes Facultad de Farmacia y Bioquímica, UBA. Junín 956 (1113) Buenos Aires, Argentina. E-mail: mmontes@qb.ffyb.uba.ar La Na,K-ATPasa, al igual que otras P-ATPasas, transporta iones a expensas de la hidrólisis de ATP mediante un mecanismo que presenta intermediarios fosforilados y no fosforilados agrupados en dos estados conformacionales principales E1 (con alta afinidad por Na+) y E2 (con alta afinidad por K+). El vanadato ha sido utilizado como un reconocido inhibidor de la actividad de las P-ATPasas(1) y actualmente está siendo empleado, junto a los complejos metal-fluoruro, en estudios cristalográficos para representar la forma E2P(2). Ha sido propuesto que el MgF4-2 y el vanadato estabilizan el estado E2 con K+ ocluido (atrapado en el interior de la proteína), conformación en la que se lograron los primeros cristales de la Na,K-ATPasa(3) . Resultados de nuestro grupo sin embargo(4), mostraron que el vanadato no desplaza totalmente el equilibrio hacia la forma E2 con K+ ocluido en la H,K-ATPasa que presenta 63% de homología de secuencia con la bomba de sodio. El presente trabajo estudia el efecto del vanadato sobre la forma E2 con y sin K+ ocluido en la Na,K-ATPasa. Evaluamos el cambio conformacional E2-E1 y la liberación de K+ desde el complejo ocluido (E2K2) en presencia y ausencia de vanadato. Observamos que el inhibidor se une a la enzima para formar un complejo: E2‑vanadato (k = 0.3 s-1) que ocluye Rb+ con una velocidad inicial 500 veces menor que la enzima sin vanadato. Frente al agregado de Na+, el inhibidor anula la transición E2®E1 pero no impide la liberación de Rb+ desde el estado ocluido (E2Rb2), proceso que ocurre a una velocidad similar a la de la enzima control. Nuestros resultados sugieren que si bien el vanadato estabiliza la enzima en E2, esto no es garantía de que el K+ se encuentre ocluído.   1. Cantley L.C., Cantley L.G. and Josephson L., J.Biol.Chem. (1978) 253, 7361. 2. Clausen J.D., McIntosh D., Woolley D. and Andersen J.P., J.Biol.Chem. (2011) 286, 11792. 3. Preben Morth J., Pedersen B., Toustrup-Jensen M., Sorensen T., Petersen J., Andersen J., Vilsen B. and Nissen P. , Nature (2007), 450, 1043. 4. Montes M., Spiaggi J., Monti J., Cornelius F., Olsen C., Garrahan P. and Rossi R. Biochim. Biophys. Acta (2011) 1818, 316.   Con subsidios de Agencia Nacional de Promoción Científica y Tecnológica, CONICET, UBA.