“Diagnóstico molecular de estrongiloidosis”

REPETTO, SILVIA ANALIA; ALBA SOTO, CATALINA D; TEKIEL, VALERIA; GONZALEZ-CAPPA, STELLA MARIS

Bahia Blanca

Congreso; VI CONGRESO ARGENTINO DE PARASITOLOGÍA; 2012

Asociación Parasitológica Argentina (APA)

“Diagnóstico molecular de estrongiloidosis” Repetto S1; Alba-Soto C1; Tekiel V2; González-Cappa S1. 1 IMPAM. UBA-CONICET. Facultad de Medicina. UBA. 2 Universidad Nacional de San Martín. Las geohelmintiosis constituyen enfermedades parasitarias frecuentes en las zonas de climas tropicales, subtropicales y templados de Argentina y un problema de salud pública importante en el Noroeste y Noreste del país. El diagnóstico de estas parasitosis se realiza por observación directa microscópica donde se identifican diferentes estadios parasitarios: huevos o larvas. Habitualmente esta metodología no es dificultosa debido al alto número de elementos parasitarios que se encuentran en materia fecal. Sin embargo, Strongyloides stercoralis (Ss) constituye un problema diagnóstico, en especial en las áreas no endémicas. Habitualmente éste se realiza por observación microscópica de larvas rabditoides en muestras de (mf). En las infecciones crónicas no complicadas, un único examen presenta una sensibilidad de 30%, por la fluctuante excreción de larvas. Para aumentar la sensibilidad deben analizarse mayor número de muestras o utilizarse métodos especiales que requieren personal entrenado y mayor dedicación horas/hombre (Baerman, Harada-Mori y/o cultivo fecal en agar nutritivo -CAN-). En las formas severas, el parásito es identificado fácilmente en materia fecal o en muestras respiratorias; sin embargo en esta instancia la mortalidad alcanza un 80%. En estas formas, la eosinofilia puede estar ausente. Por lo antedicho, se desprende que los pacientes inmunocomprometidos con infección crónica asintomática y sin riesgo de infección exógena, constituyen un problema sanitario de interés, en especial en zonas no-endémicas en las que no siempre se incluye esta parasitosis en el diagnóstico diferencial con otras patologías, así como a la falta de herramientas diagnósticas de alta sensibilidad que permitan la evaluación inicial de estos pacientes y su seguimiento post-tratamiento (pt). Este hecho conduce a subdiagnósticos y al desconocimiento de la eficacia del tratamiento. En nuestro laboratorio estandarizamos el CAN, que presento una sensibilidad de 90% y valor predictivo negativo de 91% frente a los métodos habituales basados en la visualización de larvas (examen en fresco + Ritchie) en una población con eosinofilia, fuera de área endémica, pero con antecedentes de haber residido en ella. Actualmente, el único marcador predictivo de reactivación que hemos encontrado es el incremento de eosinófilos (eo) que precede a la detección de larvas en heces, pero que resulta inespecífico. Con la finalidad de lograr una técnica específica de mayor sensibilidad diagnóstica desarrollamos una PCR convencional en materia fecal. Como primer paso, estandarizamos una técnica artesanal de extracción de ADN que permitió obtener muestras de calidad adecuada para su procesamiento por PCR a partir de materia fecal. Para determinar la sensibilidad analítica, se purificó ADN de muestras con 1 larva/g mf, utilizando en paralelo nuestro método artesanal y un kit comercial. Para el primero, las muestras se incubaron en GTES (glicina, SDS, Tris/HCL, EDTA) con posterior lisis mecánica por congelación/descongelación – sonicación. Luego se incubaron en buffer de lisis y se realizó extracción con fenol: cloroformo: alcohol isoamílico y precipitación con etanol 100%. La PCR se realizó con dos cebadores dirigidos contra el gen 18S de rRNA de S stercoralis y como templado diluciones en diez de las muestras de ADN obtenidos por ambos métodos. El límite de detección de la PCR fue de 10-2 larvas/g mf cuando el ADN se extrajo con el método artesanal y de 1 larva/g mf con el kit comercial. La amplificación de una banda única específica para S. stercoralis fue confirmada por secuenciación automática del producto de PCR. La especificidad se determinó en voluntarios sanos con estudios parasitológicos en heces negativos, y en pacientes con otras enteroparasitosis confirmadas por diagnóstico microscópico, enterobacterias, Candida albicans y Rotavirus. Evaluamos la utilidad de esta técnica respecto a los métodos tradicionales y CAN para el diagnóstico, en 25 pacientes. Todos ellos tenían diagnóstico de estrongiloidosis por los métodos convencionales, pero en todos, la PCR fue positiva más precozmente que con cualquiera de los métodos restantes, incluido el CAN. La PCR fue positiva en los 25 pacientes con el templado de ADN artesanal y solo en 18 cuando se utilizó el ADN obtenido por el kit comercial. En todos los pacientes se realizó tratamiento antiparasitario con ivermectina (dos ciclos de 200 µg/kg/día por dos días). En 12 pacientes se realizó seguimiento postratamiento (30 días- 4 años pt). Ocho pacientes evolucionaron en forma favorable, sin eosinofilia, con estudios parasitológicos habituales y el CAN negativo, pero persistió la PCR positiva. Dos pacientes presentaron reactivación de la infección parasitaria. El primero sin antecedentes de inmunocompromiso, evolucionó solo con incremento del recuento de eosinófilos al año postratamiento con CAN positivo recién en la cuarta muestra estudiada. El segundo paciente recibía tratamiento con corticoides, micofenolato y rapamicina presentó dos reactivaciones sintomáticas a los 90 y 360 días pt. El diagnóstico se realizó por métodos habituales en el primer episodio y por PCR en el segundo. En estos 2 pacientes la PCR persistió positiva durante todo el seguimiento de los ellos. Estos resultados indicarían que el tratamiento de las muestras con GTES y posterior lisis mecánica y química permite obtener ADN de calidad para efectuar una PCR para evaluar pacientes con sospecha de estrongiloidosis. La PCR en materia fecal puede resultar una herramienta útil para el diagnóstico precoz y seguimiento post tratamiento en pacientes inmunocomprometidos sin riesgo de reinfección exógena. Además, la ausencia de larvas en las muestras debería revaluarse como criterio de cura parasitológica. CITAS 1. Segarra-Newnham M. Manifestations, diagnosis, and treatment of Strongyloides stercoralis infection. Ann Pharmacother. 2007; 41:1992-2001. 2. OIE Terrestrial Manual. Validation and Quality Control ff Polymerase Chain Reaction Methods Used For The Diagnosis Of Infectious Diseases. C h a p t e r 1.1. 5. 2008. 3. Mark Dorris PhD. Reversing the effects of formalin fixation. Thesis 1999. 4. Ian Wilson. Inhibition and facilitation of nucleic acid amplification. Applied and environmental microbiology. 1997; 3741-51. 5. Waleed Abu Al-Soud et al. Effects of Amplification Facilitators on Diagnostic PCR in the Presence of Blood, Feces, and Meat. Journal of Clinical Microbiology. 2000; 38: 4463-70. 6. Jaco J. Verweij et al. Molecular diagnosis of Strongyloides stercoralis in faecal samples. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 2009; 103:342-6. Trabajo subsidiado por FONCYT y UBA.