Inmovilización de la enzima de hiosciamina 6β-hidroxilasa a hidrogeles de quitina para su reutilización en la producción de anisodamina y escopolamina

MINOIA, JUAN MAURICIO; VILLANUEVA, MARÍA EMILIA; COPELLO, GUILLERMO; RODRIGUEZ TALOU, JULIAN; CARDILLO, ALEJANDRA BEATRIZ

Simposio; XIII Simposio REDBIO Argentina 2021 VIRTUAL, REDBIO 2021.; 2021

REDBIO

La enzima hiosciamina 6β-hidroxilasa (H6H) es el catalizador final de la ruta biosintéticade escopolamina y se encuentra en diversas especies de pantas de la familia Solanacea.Tanto el sustrato de la enzima ?hiosciamina? como sus productos ?anisodamina yescopolamina? poseen propiedades farmacológicas y son utilizados como principiosactivos en diferentes fármacos. El método de producción actual se basa en el cultivo delas plantas y su posterior extracción. Sin embargo, la planta no es capaz de produciranisodamina y escopolamina ?esta última de mayor valor comercial? en elevadasconcentraciones aun encontrándose presente su precursor.En este trabajo se investiga la utilización in vitro de la H6H proveniente de la plantaBrugmansia candida fusionada a un dominio de afinidad a quitina (ChBD) e inmovilizadaen partículas de hidrogel de quitina con el objetivo de transformar hiosciamina en susproductos. Para ello, la construcción ChBD-H6H se clonó en el vector pET-22(b) y seexpresó de forma recombinante en cepas de E.coli Origami (DE3). Posteriormente, seevaluó la inmovilización y actividad enzimática utilizando buffer Tris-ClH 50 mM pH 7,6en dos condiciones de fuerza iónica diferente, A=750 mM (n=3) y B=1 M NaCl (n=2).Cada inmovilización se llevó a cabo por exposición de los extractos de proteína solublesclarificados con las matrices de quitina en una relación 1,5 ml volumen de matriz ? 3 mgproteínas solubles totales, evaluándose la unión específica de la enzima ChBD-H6Hmediante SDS-PAGE teñidos con azul brillante de Coomassie y Western-Blot contra laproteína H6H. De forma seguida, las enzimas inmovilizadas fueron sometidas a cincociclos de reacción (24h/ciclo, 30°C, 200 rpm) y la conversión de hiosciamina fue evaluadamediante cromatografía líquida de alta performance. El porcentaje de bioconversión aanisodamina comparando las condiciones A y B en los ciclos de reacción 1 (75,9±3,6 vs31,0 ±2,5) y 2 (53,7±2,0 vs 35,8±0,8) fue significativamente diferente (p