Expresión de hiosciamina 6b-hidroxilasa de Brugmansia candida y su aplicación en procesos biotecnológicos para la obtención de escopolamina y anisodamina

CARDILLO, ALEJANDRA BEATRIZ

Córdoba

Congreso; II Reunión de Biotecnología Aplicada a Plantas Medicinales y Aromáticas; 2009

MinCyT Córdoba / REDBIO

Expresión de Hiosciamina 6b-hidroxilasa de Brugmansia candida y su aplicación en procesos biotecnológicos para la obtención de escopolamina y anisodamina. Cardillo, Alejandra Beatriz Microbiologia Industrial y Biotecnologia, Facultad de Farmacia y Bioquimica, Universidad de Buenos Aires. Argentina. Email: acardillo@ffyb.uba.ar Una gran proporción de los productos naturales usados como drogas provienen de plantas. Ejemplo de ello son los alcaloides del tropano, un importante grupo de metabolitos secundarios que han sido historicamente empleados en medicina debido a sus propiedades anticolinergicas. Hiosciamina, anisodamina y escopolamina son los productos finales de la ruta biosintetica de los alcaloides del tropano. La escopolamina tiene mayor valor economico y demanda mundial respecto a la hiosciamina y atropina. Recientemente, se han descripto aplicaciones terapeuticas potenciales para la anisodamina lo que ha despertado interes en este alcaloide. Debido a las dificultades y costos que representa la sintesis quimica de estos alcaloides, en la actualidad estos son obtenidos mediante la explotacion de la fuente natural. Es por esta razon que resulta de gran interes para la industria farmaceutica el desarrollo de metodos alternativos para su produccion. Teniendo en cuenta el valor comercial de la escopolamina y el interes emergente por anisodamina se analizaron dos estrategias para la produccion de estos alcaloides. Primeramente, se construyeron cepas de Saccharomyces cerevisiae que expresan el gen de la enzima  hiosciamina 6b-hidroxilasa (H6H, EC 1.14.11.11) para ser utilizada como biocatalizador recombinante en procesos de biotransformacion de hiosciamina en anisodamina y/o escopolamina. El h6hADNc fue clonado en los vectores de expresion para levaduras pYES2.1/V5-His-TOPO y pYES2.1. Como resultado del clonado en el vector pYES2.1/V5-His-TOPO, la H6H fue expresada como proteina de fusion, unida al extremo C-terminal al epitope antigenico V5 y una cola de 6 histidinas. La actividad de la enzima recombinante fue ensayada a partir de extractos proteicos crudos de las dos cepas. Los resultados mostraron que H6H con y sin etiqueta fue capaz de transformar hiosciamina en anisodamina y/o escopolamina debido a la expresion funcional del h6hADNc. La enzima no etiquetada present¨® una taza de conversion de hiosciamina superior a la de la enzima etiquetada adem¨¢s de ser capaz de producir escopolamina en los tiempos de incubacion ensayados. Por otra parte, se analizo el contenido y perfil de hiosciamina, anisodamina y escopolamina en plantulas y raices transformadas de dos ecotipos de B. candida. Las raices de plantas in vitro del ecotipo colombiano, presentaron el contenido mas alto de alcaloides del tropano respecto a los restantes organos analizados. Las raices transformadas argentinas presentaron un contenido superior de alcaloides respecto al producido en las raices transformadas colombianas. En las primeras, anisodamina fue el alcaloide predominante mientras que en las segundas fue hiosciamina. Las raices transformadas argentinas produjeron el contenido mas elevado de anisodamina. De acuerdo a los resultados obtenidos puede concluirse que las cepas de S. cerevisiae obtenidas son prometedoras para aplicaciones tecnologicas en la produccion de anisodamina y escopolamina por biotransformacion. Ademas, las raices transformadas de B. candida de origen argentino son una opcion de produccion de anisodamina promisoria que deberia ser explorada debido a los valores elevados de anisodamina medidos y por el renovado inter¨¦s en la utilizacion de cultivos vegetales in vitro para una aplicacion a gran escala en la produccion de sustancias bioactivas.