Expresión de la enzima hiosciamina 6b-hidroxilasa en Brugmansia candida

CARDILLO, ALEJANDRA BEATRIZ; MARCONI, PATRICIA; STUMPO, RITA; GIULIETTI, ANA MARÍA

La Plata

Jornada; XI Jornadas de Jóvenes Investigadores de AUGM; 2003

Introducción: Brugmansia candida es una especie nativa de Sudamérica productora de la escopolamina presenta actividad farmacológica debido a su acción anticolinérgica. Este alcaloide tiene mayor valor comercial y demanda mundial respecto a su precursor la hiosciamina. La enzima hiosciamina 6-b-hidroxilasa (EC 1.14.11.11) es la última enzima en la ruta de los alcaloides del tropano la cual cataliza la conversión de hiosciamina en escopolamina. Objetivos: Estudiar la expresión del gen h6h en distintos órganos de plantas B. candida. Materiales y métodos: plantas de B. candida, obtenidas en el “Jardín Botánico” de Buenos Aires. El ARN total fue aislado a partir de extractos de raíces, hojas, anteras y óvulos utilizando la técnica clásica con Trizolâ (Gibco). Además, se realizaron extracciones con el kit RNeasy Plant (Qiagen). La integridad y tamaño del ARN total obtenido fue evaluado por electroforesis en gel desnaturalizante de agarosa con buffer MOPS (Sambrook et al, 1989). RT-PCR: Para la síntesis del ADNc se empleó la retrotranscriptasa Superscript ll (Gibco).    PCR: las reacciones de PCR fueron llevadas a cabo con primers específicos para el gen h6h de Hyoscyamus niger dada la alta homología entre las diferentes especies de la familia Solanaceae. Resultados: Los tejidos fueron congelados con N2 líquido y molidos. La concentración de ARN total obtenida fue de 0.040 ±0.011 mg realizando la extracción con Trizol® y de 0.169±0.09 mg utilizando el RNeasy Plant MINI KIT. Sin embargo, cuando se utilizó un Ultraturrex como homogeneizador la concentración obtenida con Trizol® fue elevada a 0.578 ±0.08 mg. Los resultados obtenidos por las electroforesis en geles desnaturalizantes muestran 4 bandas (25, 23, 18 y 16 S). Para el tratamiento con Ultraturrex no puede distinguirse este mismo perfil. Una banda de aprox. 1 Kb fue obtenida a partir de las muestras de ARN total de anteras y raíces. La banda de 1 Kb fue aislada y clonada en un vector de expresión para futuros ensayos. Conclusiones: La presencia del gen h6h pudo ser verificada en B. candida. La evaluación de la expresión tejido específica de la enzima mostró resultados positivos solo en anteras y en raíces (producto de PCR de 1Kb).