Expresión de la Hiosciamina 6b-hidroxilasa de Brugmansia candida en Saccharomyces cerevisiae y su potencial aplicación industrial

CARDILLO, ALEJANDRA BEATRIZ; GIULIETTI, ANA MARÍA

Córdoba

Congreso; I Reunión de Biotecnología aplicada a plantas medicinales y aromáticas; 2006

(1)   Expresión de la Hiosciamina 6b-hidroxilasa de Brugmansia candida en Saccharomyces cerevisiae y su potencial aplicación industrial Alejandra B. Cardillo, Ana M. Giulietti Cátedra de Microbiología Industrial y Biotecnología, Facultad de Farmacia y Bioquímica UBA. Junín 956, 6º piso. Argentina. E-mail: acardillo@ffyb.uba.ar Introducción Brugmansia candida es una planta originaria de Sudamérica perteneciente a la familia Solanaceae. Como otros miembros de la familia tiene la capacidad de producir los alcaloides del tropano, un importante grupo de metabolitos secundarios. Entre ellos, la hiosciamina y escopolamina encuentran una amplia aplicación en el campo de la medicina. La escopolamina es de mayor interés para la industria farmacéutica ya que ésta posee una mayor utilidad médica, siendo su demanda unas 10 veces superior a la de su precursor, la hiosciamina (Palazón et. al., 2003). La conversión de hiosciamina en escopolamina es llevada a cabo mediante dos reacciones químicas catalizadas por la hiosciamina 6b-hidroxilasa (H6H, EC 1.14.11.11). El desarrollo de un biocatalizador microbiano que exprese la enzima vegetal con el fin de llevar a cabo el proceso de biotransformación para la obtención de escopolamina es una estrategia útil e interesante. Saccharomyces cerevisiae es un huésped de elección para la expresión de proteínas heterólogas a nivel productivo por varias razones tales como, la simplicidad y amplio conocimiento de su cultivo, su condición de GRAS (generally regarded as safe) y la capacidad de llevar a cabo modificaciones post-traduccionales. El objetivo de este trabajo fue clonar y expresar la enzima vegetal H6H en S. cerevisiae para una posterior aplicación en procesos industriales como biocatalizador. Metodología Extracción de ARN total: A partir de hojas, tips de raíces, tallos, anteras inmaduras y  raíces transformadas (HR) de B. candida se hicieron extracciones de ARN total mediante el RNeasy Plant Mini Kit (Qiagen). Tanto la integridad como la distribución de las distintas especies de ARN aisladas fueron analizadas por electroforesis en geles de agarosa en condiciones desnaturalizantes (formaldehído/formamina). RT-PCR y PCR: El diseño de primers se hizo en base a la secuencia publicada en bases de datos para el gen de la enzima H6H de Hyoscyamus niger (Genbank, M62719). Clonado del ADNc en el vector de expresión: El producto de PCR de 1000 pb fue purificado y clonado en el pYES2.1-TOPO TA vector (Invitrogen). Las construcciones obtenidas fueron confirmadas por secuenciación. Asimismo, los resultados obtenidos fueron analizados mediante herramientas bioinformáticas disponibles en la web. Las construcciones positivas fueron introducidas, mediante la transformación química con acetato de litio (Ito et al., 1983), en Saccharomyces cerevisiae CEN PK2 (Acc. n° 30000D, Eurofan) (Mata/Mata ura3-D2/ura3-D2 trp1-289/trp1-289 leu2-3, 112/leu2-3, 112 his3D1/his3D1 mal2-8 C/mal2-8 C suc2/suc2) cedida gentilmente por la Dra. Susana Silverstein, IFYBINE-CONICET, FCEN. Los clones obtenidos fueron seleccionados en medio mínimo YNBD sin uracilo. Inducción de la expresión del gen clonado: A partir de los cultivos inducidos con galactosa se hicieron extractos proteicos a distintos tiempos mediante la disrupción mecánica de las células con bolillas de vidrio e inhibidores de proteasas (PMSF). La expresión de la enzima fue verificada mediante la detección inmunoquímica del epitope V5 fusionado por Westernblot (Laemmli, 1970). Ensayos de inhibición del crecimiento de levaduras wild type y recombinantes: La cepa de S. cerevisiae CEN PK2 wild type (wt) y la recombinante obtenida fueron ensayadas en cuanto a su tolerancia a concentraciones crecientes de hiosciamina y escopolamina. El cultivo de 12 – 14 hs (ON) de la cepa wt y la cepa recombinante sometida al inductor fueron sembradas en diluciones seriadas en placas multiwell conteniendo concentraciones crecientes de los alcaloides. Las placas fueron incubadas durante 3 días a 30ºC. Resultados y discusión El ADNc h6h fue amplificado por RT-PCR y PCR a partir de las preparaciones de ARN total. Las técnicas mencionadas permitieron determinar la abundancia relativa del ARNm h6h. De todas las muestras estudiadas, las anteras inmaduras mostraron la señal más intensa. Por ésta razón se eligió a éste tejido como fuente del gen. Los ADNc que codifican la enzima fueron clonados en el vector de expresión en levaduras pYES2.1-TOPO y las construcciones obtenidas fueron secuenciadas. Los resultados obtenidos indican que el gen clonado tiene un marco de lectura abierto (ORF) de 1038 pb del cual se predice una secuencia aminoacídica de 344 aa. Por otra parte, los alineamientos hechos en bases de datos de la NCBI muestran que nuestra secuencia tiene una homología elevada (97 – 98% de identidad) respecto a la secuencia publicada para el mismo gen en H. niger. (Genbank accession number AAA33387.1). El dominio de unión a metales que posee la enzima (2OG-Fe (II) oxygenase superfamily domain) se encuentra conservado en B. candida. La enzima clonada es expresada a partir de las 4hs posteriores a la inducción con galactosa por aparición en el Western blot de la banda detectada con los anticuerpos. No se observó degradación de la enzima en el tiempo ensayado. Con respecto a los ensayos de inhibición del crecimiento de levaduras, la cepa wt es capaz de soportar concentraciones de 150 mM de escopolamina y solo 50 mM de hiosciamina. Por otra parte, la recombinante tolera la máxima concentración de ambos alcaloides (150 mM) (Figura 1 y 2). Esto podría ser atribuido a que la enzima H6H en los organismos recombinantes permitiría la conversión de hiosciamina en escopolamina la cual es mejor tolerada por las levaduras. Figura 1.- Levaduras wt y recombinantes crecidas en presencia de concentraciones crecientes de escopolamina. Figura 2.- Levaduras wt y recombinantes crecidas en presencia de concentraciones crecientes de hiosciamina. Conclusiones En base a los resultados obtenidos, se concluye que la enzima H6H se encuentra altamente conservada en la familia Solanaceae tal como se había propuesto en trabajos previos (Matsuda et al, 1991). Por otra parte, las levaduras recombinantes portadoras de la H6H son capaces de soportar mayores concentraciones de hiosciamina lo que sería una evidencia de su capacidad de transformar hiosciamina en escopolamina. Bibliografía Ito H., et al (1983). J Bacterial, 153: 163-168. Laemli U.K. (1970). Nature, 227: 680-685. Matsuda J., et al (1991). J. Biol. Chem., 266: 9460-9464. Palazón J., et al (2003). Plant Science, 165: 1289–1295.