INVESTIGADORES
CARDILLO Alejandra Beatriz
congresos y reuniones científicas
Título:
Levaduras recombinantes como herramienta para el desarrollo de procesos de biotransformación de interés en la industria farmacéutica
Autor/es:
CARDILLO, ALEJANDRA BEATRIZ; RODRIGUEZ TALOU, JULIÁN; GIULIETTI, ANA MARÍA
Lugar:
Buenos Aires
Reunión:
Congreso; JorFyBI 2007 XI Congreso Argentino de Farmacia y Bioquímica Industrial; 2007
Resumen:
Introducción: Los procesos de biocatálisis o biotransformación son una tecnología de uso frecuente en la industria biotecnológica. Estas reacciones tienen escaso impacto adverso sobre el medio ambiente, es por ello que actualmente se está tendiendo a reemplazar las catálisis químicas por biocatalizadores. Saccharomyces cerevisiae está siendo extensamente aplicada en la industria farmacéutica para la producción de proteínas recombinantes. Dentro del campo de la biotecnología resulta un organismo muy atractivo debido a la existencia de tecnologías de procesos y fermentaciones bien establecidos y aplicables a gran escala. Los alcaloides del tropano son un importante grupo de metabolitos secundarios producidos principalmente por plantas de la familia Solanaceae, entre ellas, Brugmansia candida. La escopolamina posee una gran utilidad farmacéutica debido a su acción anticolinérgica. Este alcaloide tiene mayor valor económico y demanda mundial respecto a la hiosciamina y atropina (un orden de magnitud inferior). La enzima hiosciamina 6-b-hidroxilasa (H6H, EC 1.14.11.11) es la última enzima en la ruta de los alcaloides del tropano que cataliza la conversión de hiosciamina en escopolamina mediante dos reacciones químicas, la primera de hidroxilación seguida de la epoxidación. El objetivo de nuestro trabajo ha sido clonar y expresar la enzima H6H de B. candida en S. cerevisiae para un uso potencial como biocatalizador en la producción de escopolamina. Materiales y Métodos: El fragmento de 1 Kb que codifica para la H6H, obtenido por PCR a partir del ARN total de anteras inmaduras de B. candida, fue clonado en dos vectores, el pYES2.1-TOPO TA vector en el cual, la enzima fue clonada como una proteína de fusión para facilitar su detección y purificación y por otra parte en el pYES2. Las construcciones positivas fueron introducidas en S. cerevisiae CEN PK2, cedida por la Dra. S. Silverstein, IFYBINE-CONICET, FCEN, mediante la técnica de transformación química con acetato de litio. Los cultivos recombinantes, inducidos por el agregado de galactosa, fueron analizados en cuanto a la expresión de la enzima por Westernblot. Ensayos de actividad enzimática: están siendo llevados a cabo mediante el protocolo de Hashimoto et al, 1987. La detección de los alcaloides se está llevando a cabo mediante HPLC, técnica desarrollada en la cátedra para detectar bajas concentraciones de alcaloides. Por otra parte, se inició la purificación de la enzima para su posterior secuenciación. En una primera instancia, se combinó la purificación mediante las 6 histidinas fusionadas por IMAC con HPLC. Para ello se utilizó una columna C8, eluyendo mediante un gradiente Acetonitrilo+TFA: Agua+TFA (Acetonitrilo 5% a 95%). Posteriormente se hicieron dos purificaciones sucesivas por IMAC previo desalado de las muestras. Resultados: La enzima clonada es expresada a partir de las 4hs posteriores a la inducción con galactosa por aparición en el Westernblot de la banda detectada con los anticuerpos. No se observó degradación de la enzima en el tiempo ensayado. En cuanto a la detección de los alcaloides, ha sido posible detectar concentraciones de hasta 2 ppm de hiosciamina y escopolamina. Actualmente se están haciendo ajustes en el protocolo de Hashimoto para determinar la actividad de la enzima de B. candida tanto en preparaciones crudas de la enzima como semi-puras. Por otra parte, la técnica IMAC ha permitido concentrar la enzima aunque se han detectado pequeñas cantidades de proteínas contaminantes. El acople de la técnica de HPLC afectó la integridad de la enzima. En el acople de IMAC se recuperó poca proteína. Por ello, se decidió secuenciar la enzima por MS-MS a partir de geles de poliacrilamida. Conclusiones: Se logró desarrollar y poner a punto un método de HPLC para la detección de los alcaloides hiosciamina y escopolamina con la sensibilidad requerida para los ensayos de actividad in vitro. En un pasaje por IMAC, se logró enriquecer los extractos proteicos en la proteína recombinante. Sin embargo, en el segundo pasaje bajó el rendimiento. Actualmente se está secuenciando la enzima y se están llevando a cabo los ensayos de actividad enzimática. Referencias: T. Hashimoto and Y. Yamada. Eur. J. Biochem. 164, 277-285 (1987)
rds']