Determinación de gliotoxina a partir de cultivos de Aspergillus fumigatus mediante un procedimiento de extracción a pequeña escala y detección por LC-MS/MS

GABRIELA PENA; MARIA PILAR MONGE; CAVAGLIERI LILIA; LANDA FLORENCIA; ROSA CARLOS; DALCERO ANA; CHIACCHIERA STELLA

Rio Cuarto

Congreso; VII Congreso Latioamericano de Micotoxicología; 2013

Aspergillus fumigatus es un hongo frecuentemente aislado de alimentos para animales contaminados y es capaz de producir micotoxinas tremorgénicas. La gliotoxina (GLI), con potentes efectos inmunosupresivos, genotóxicos, citotóxicos y apoptóticos, es la principal toxina de este hongo. En este estudio se propone un procedimiento de extracción de GLI a pequeña escala rápido, simple y de bajo impacto ambiental, vinculado a un método de cromatografía líquida acoplada a espectrometría de masas en tándem (LC-MS/MS) para la determinación de la toxina a partir de extractos fúngicos de A. fumigatus. Para la evaluación de la metodología, se ensayó la habilidad de producción de GLI por 143 cepas de A. fumigatus en agar sacarosa extracto de levadura (YES) luego de 7 días de incubación a 25°C. Las cepas fueron aisladas previamente de alimentos para animales. Para la extracción de GLI, se removieron tres tacos de agar del área central de la colonia, se pesaron y se introdujeron en un vial pequeño. Se agregó Cloroformo (1 ml) a cada vial y la mezcla solvente-muestra se centrifugó a 7.500 g durante 20 min. El sobrenadante se filtró a través de filtros de nylon y 800 µl fueron evaporados a sequedad bajo N2. Los extractos secos fueron re-disueltos en 800 µl de fase móvil (metanol:agua, 20:80, v/v) y utilizados para su análisis por LC-MS/MS. Se aplicó el método cromatográfico propuesto por Sulyok y col. (2007) para análisis multitoxina. Los límites de detección (LOD) y cuantificación (LOQ) fueron determinados en muestras fortificadas y soluciones testigo de GLI basados en la relación señal/ruido (S/N) de 3:1 para LOD y de 10:1 para LOQ. Para el ensayo de recuperación de GLI, placas de medio YES fueron fortificadas a dos niveles e incubadas a 25°C durante 24 hs. Se calcularon las desviaciones estándar relativas (RSDr) de las mediciones registradas en un mismo día (repeteabilidad) y en días diferentes (reproducibilidad). Se utilizó, en todos los casos, calibración ajustada por matriz (AM) para corregir la eventual supresión iónica resultante de la co-elusión de compuestos matriciales. Los niveles de GLI fueron expresados como ng/g de micelio en YES. Se observó un comportamiento lineal en la curva de calibración, y= 5,474.5 x (R2 = 0.9925, n=12), en el rango de 0,25 a 3.000 ng inyectados de GLI. El LOD instrumental (S/N=3) fue 0,25 ng. Los porcentajes promedio de GLI recuperados a partir de los medios fortificados con 5 y 7µg/g fueron 100,3 y 92,4% con RSDr de 6,6 y 3,8%, respectivamente. Se obtuvo adecuada repeteabilidad y reproducibilidad de los resultados determinados a diferentes concentraciones de GLI (0,5-1.000 ng inyectados), con valores que oscilaron entre 0,3-5,4 y 3,9-12,7%, respectivamente. Las cepas evaluadas fueron capaces de producir GLI en niveles que variaron desde concentración no detectable (niveles por debajo del LOD) a 3.430,5 ng/g. Los resultados de este trabajo sugieren que el procedimiento de extracción de GLI propuesto, acoplado con una metodología adecuada de LC-MS/MS resulta eficiente, simple y útil para la determinación de esta toxina a partir de extractos de A. fumigatus. Permite reducir el volumen de solvente orgánico utilizado, permitiendo trabajar de manera más segura y rápida y reduciendo el impacto al medioambiente.